Adr1-abhängige Regulation von Genen für FAS II-Enzyme

Das vorliegende Einjahresprojekt ist der Untersuchung der Rolle des Transkriptionsfaktor Adr1p aus Hefe gewidmet, und zwar hinsichtlich seiner Regulation von Genen, die an der mitochondrialen Typ II Fettsäuresynthese teilnehmen (FAS II). Es wird angenommen, dass FAS II auch in humanen Mitochondrien funktionell ist, und trotz Identifizierung einer Reihe humaner FAS II Enzyme weiß man relativ wenig über die Mechanismen, die ihre Expression steuern. Die Wichtigkeit der Untersuchung der Regulation dieses mitochondrialen Prozesses ergibt sich aus der Entstehung von Krankheit und Mortalität bei mitochondrialen Störungen. Wir schlagen vor, die Regulation dieses analogen Prozesses in den Mitochondrien von Hefe zu studieren. Hefe FAS II stellt eine kritische Komponente für mitochondriale Funktionen dar, da das Fehlen von Proteinen dieses Stoffwechselweges, zu Störungen in der Zellatmung führt. FAS II-defekte Hefe enthält nur rudimentäre Mitochondrien, kann keine Cytochromkomplexe bilden, und ist unfähig auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen zu wachsen. Es gibt überzeugende Befunde, dass zumindest eines der für FAS II Enzyme kodierenden Gene, ETR1, einer Regulation durch Adr1p unterworfen ist. Erst vor kurzem wurde die Hypothese aufgestellt, dass auch die mitochondriale FAS II über den gleichen, auf Adr1p basierenden Regelkreis wie die Fettsäure ß-Oxidation in Peroxisomen reguliert wird. Diese Idee stellt einen attraktiven Vorschlag zur genaueren Untersuchung dieses Sachverhaltes dar. Die geplanten Studien sollten nicht nur präziseres Wissen über die Regulation der Fettsäuresynthese in Mitochondrien liefern, sie könnten darüber hinaus zur Identifizierung neuer Regelkreisläufe führen, die für eine gemeinsame Regulation zur Erhaltung und Ausbreitung von Mitochondrien und Peroxisomen verantwortlich sind.

Saccharomyces cerevisiae ETR1, welches die 2-trans-Enoyl-ACP Reduktase der mitochondrialen Typ 2 Fettsäuresynthase (FASII) kodiert, ist für die Transkriptionsregelung von Adr1p abhängig. Eine vorangegangene Genom-weite Profilerstellung hat gezeigt, dass ETR1 in Wildtypzellen 3.2-fach stärker exprimiert wird als in adr1Δ-mutierten Zellen. Zusätzlich bindet der ETR1 Promotor Adr1p in vivo über eine dort residente Adr1p-bindende Stelle, die Typ 1 upstream-Aktivierung-Sequenz (UAS1) genannt wird. Hier wurde untersucht, ob Adr1p zusätzliche FASII Gene regelt. Die FASII-Steuerung zu studieren ist wegen mehrerer Aspekte von großer Bedeutung: FASII-defiziente Hefezellen haben nur kleine unterentwickelte Mitochondrien, sie können keine Zytochromkomplexe assemblieren und können auch nicht auf nichtfermentierbaren Kohle-Quellen wachsen oder Liponsäure synthetisieren. Die Transkriptionsregulierung von sechs zusätzlichen FASII Genen wurde mit Promotor-lacZ Fusionen studiert, indem sie sowohl in Wildtyp als auch in adr1Δ-mutierten Zellen verfolgt wurden. Die Zellen sind auf mit Glukose angereichertem Medium gewachsen, welches das chromogene Substrat X-Gal enthielt. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass auch die Expression von ACP1, OAR1, und PPT2 - deren Promotoren, Sequenzen mit dem Potential enthalten, funktionelle UAS1s zu repräsentieren - von Adr1p abzuhängen scheint. In Bezug auf Etr1p hat immunoblotting gezeigt, dass im Wildtyp und in adr1Δ- mutierten Zellen die Mengen von Etr1p ununterscheidbar waren, obwohl die Transkription des entsprechenden ETR1 Gens von Adr1p geregelt wird. In beiden Hefestämmen hat die Expression mehrfacher Kopien von ETR1 hinter dem Nativen Promoter zu ähnlichen Reduktase-Aktivitäten geführt, und auch der Liponsäure-Inhalt war bei beiden Stämmen gleichwertig. Die kombinierten Ergebnisse werfen begründete Zweifel darüber auf, ob die Transkriptionsregelung, die von Adr1p auf ETR1 ausgeübt wird, die einzige - oder bedeutungsvollste- Steuerungsebene für FASII in Wildtypzellen ist. Die Möglichkeit einer zusätzlichen Regelung, die auf der Translations-Ebene stattfinden kann, ist in Betracht zu ziehen. Deshalb werden derzeit die nicht-translatierten Sequenzen von ETR1 und anderen FASII Genen, die möglicherweise von Adr1p geregelt werden, in Hinblick auf eine Beteiligung an der Translations-Steuerung analysiert.