Potentielle Säugerhomologe einer Peptidyl-L/D-isomerase

Die Haut von Amphibien enthält viele interessante bioaktive Peptide. In einigen von ihnen besteht der zweite Rest aus einer D-Aminosäure. Beispiele sind die Dermorphine und Deltorphine, sowie die Peptidantibiotika Bombinin H. Im Fall der Opioidpeptide sind die gesamt L-Formen inaktiv, während zwischen den Diastereomeren von Bombinin H subtile Unterschiede in der Aktivität zu bestehen scheinen. Bereits früher wurde durch cDNA Klonierung gezeigt, daß die D-Aminosäure von einer L-Aminosäure des jeweiligen Peptidvorläufers stammt. Aus den Hautabsonderungen von Bombinae wurde ein Enzym gereinigt, das die Isomerisierung eines L-Isoleucines in der zweiten Position eines Modellpeptides in ein D-allo-Isoleucin katalysiert. Diese L/D-Isomerase wirkt durch Deprotonierung-Protonierung des alpha-Kohlenstoffes des zweiten Restes des Substrates scheinbar ohne Kofaktor. Aus Teilen der Proteinsequenz, klonierter cDNA und genomischer DNA konnte die Primärstruktur dieser Isomerase abgeleitet werden. Gene, die diesem Enzym aus der Froschhaut verwandte Polypeptide kodieren, findet man bei vielen Wirbeltieren und auch dem Menschen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen konzentriert sich das vorgeschlagene Projekt auf zwei grundsätzliche Fragen: 1) Die Bestimmung der Substratspezifität mit der Absicht, eine Vorstellung zu erhalten, welche anderen Froschpeptide möglicherweise eine D-Aminosäure enthalten könnten, und 2) kodieren die der Froschisomerase verwandten Gene in verschiedenen Wirbeltieren eine aktive L/D- Isomerase ? Im speziellen soll die Expression eines Teiles eines menschlichen Genes, das die aminoterminale Domäne des Fc-gamma bindenden Proteins mit signifikanter Ähnlichkeit zur Froschisomerase kodiert, studiert werden: Durch die Anwesenheit eines solchen Enzymes in bestimmten Geweben oder Sekreten würde die Möglichkeit entstehen, daß auch Substrate vorhanden sind, dh. Peptide, in denen eine L-Aminosäure in die D-Form konvertiert wurde. Diese könnten bekannte Hormone, Neurotransmitter, antimikrobielle Peptide, usw. sein, für die auch ein Diastereomer existiert.

In der Haut der Feuerbauchunken befindet sich eine Peptidyl-aminoacyl-L/D-isomerase, welche die postranslatorische Isomerisierung des zweiten Restes der Substratpeptide von der L- zur D-Form katalysiert. Zuvor wurde dieser neue Enzymtyp zu einem gewissen Grad charakterisiert und Gene, die ähnliche Polypeptide kodieren, finden sich in mehreren Wirbeltierarten wie auch beim Menschen. Diese Isomerase benutzt einen Deprotonierungs- /Protonierungsmechanismus. Wir haben peptid-basierte Substratanaloga mit planaren alpha,beta-ungesättigten Resten in der zweiten Position synthetisiert. Es stellte sich heraus, daß diese Verbindungen potente Inhibitoren der Enzymreaktion sind. Diese Resultate unterstützen stark die Vorstellung, daß die Reaktion über einen planaren Übergangszustand abläuft, nämlich über ein Enolat-Anion. Darüber hinaus analysierten wir mittels fluoreszenzmarkierter Varianten des natürlichen Substrates Bombinin H die Substratspezifität dieser Isomerase. Überraschenderweise besitzt dieses Enzym eine ziemlich geringe Selektivität für die Reste in der zweiten Position, wo der Wechsel der Chiralität stattfindet. Die Expression eines Enzymes mit einem derartig breiten Substratspektrum in anderen Spezies hätte wahrscheinlich die Bildung von Peptiden mit einer D-Aminosäure zur Folge. Tatsächlich sind in den Datenbanken zahlreiche Peptide aus Amphibien und auch Säugern deponiert, welche die hier bestimmten Erfordernisse erfüllen. Die Frage, ob solche Peptide in der Natur selten sind, oder ob wir bisher nur die sprichwörtliche Spitze des Eisberges gesehen haben, bleibt offen, allerdings lassen unsere Daten die letztere Möglichkeit als wahrscheinlicher erscheinen. Ein mögliches Substrat für ein solches Enzym ist das anionische Dermaseptin (aDrs) aus der Haut des Mexikanischen Laubfrosches, das bei neutralem pH eine negative Nettoladung besitzt. In einer ersten Studie konnten wir keine Anzeichen für eine antibakterielle oder zytotoxische Wirkung des löslichen aDrs feststellen. Dagegen fügt sich das Peptid in einer reversiblen, pH-abhängigen Weise selbstständig zu Amyloid-Fibrillen zusammen. Interessanterweise können aus einem solchen Amyloid-Depot durch eine Verschiebung des pH schnell metastabile amorphe Aggregate freigesetzt werden, die einen starken zytotoxischen Effekt vermitteln können. aDrs kann daher als weiterer Kandidat für ein funktionelles Amyloid betrachtet werden. Bombinine H, die natürlichen Substrate der Bombina L/D-isomerase, sind besonders reich an Glycin (25 %), was auch zu einem Strukturpolymorphismus führen kann. Tatsächlich fanden wir unter Bedingungen, welche die Selbstaggregation dieser hydrophoben Peptide auslösen, daß die Stereochemie des ungeordneten aminoterminalen Segmentes die Neigung, sich zu bestimmten Sekundärstrukturen zu falten, moduliert. Daher könnte die Stereochemie bei diesen Mitgliedern der aufkommenden Klasse von selbst-aggregierenden Froschpeptiden die Selbst-Organisation modulieren mit weitreichenden Konsequenzen für das angeborene Immunsystem, für welches Froschhaut ein bewährtes Modellsystem ist.