Charakterisierung von COM1/SAE2 in Arabidopsis thaliana

Die Meiose ist jener Prozess, der in der Genese der Gameten die Reduzierung der Chromosomenzahl um die Hälfte sicherstellt. Nach Duplikation der paternalen und maternalen Chromosomen werden in einer ersten Zellteilung, der Meiose I, die homologen Chromosomen getrennt, und in einer darauf folgenden zweiten, der Meiose II, die Schwesterchromatiden. In der Meiose I findet ein reziproker Austausch von Erbmaterial durch Rekombination zwischen homologen Chromosomen statt. Der Prozess der homologen Rekombination trägt zur genetischen Diversität der meiotischen Produkte bei, ermöglicht DNA Reparatur und ist für die korrekte Verteilung der homologen Chromosomen unerläßlich. Notwendig für die homologe Rekombination ist das kontrollierte Einführen von DNA Doppelstrangbrüchen (DSBs) durch das mit Topoisomerasen verwandte Protein Spo11 und einigen weiteren anderen Proteinen. Als ein Zwischenprodukt der Schneidereaktion ist Spo11 kovalent an 5` Enden der DNA gebunden. Das Entfernen von Spo11 von den DNA Enden, durch schneiden von einzelsträngiger DNA und somit Freisetzung von Spo11 gebunden an einige Nukleotide, ist essentiell und benötigt, soweit bekannt, in der Bäckerhefe zumindest die Aktivität der Proteine Mre11, Rad50 und Com1/Sae2. Dieser Projektantrag beschreibt die erste Charakterisierung von COM1/SAE2 in einem höheren Organismus, in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana (AtCOM1). Erste, hier präsentierte Ergebnisse belegen, dass es homologe Gene in höheren Organismen gibt und dass AtCOM1 essentiell für die Meiose in A. thaliana ist. Dieser Projektantrag beschreibt Experimente, zu sieben klar definierten Fragestellungen: (1) Welcher Defekt liegt der Sterilität der Atcom1 Mutanten zu Grunde? (2) In welchem epistatischen Verhältnis steht AtCOM1 zu anderen meiotischen Genen? (3) Zu welchem Zeitpunkt während der Meiose ist AtCOM1 aktiv und wo befindet sich AtCOM1? (4) Ist das Prozessieren meiotischer DSBs abhängig von AtCOM1? (5) Welche Proteine interagieren mit AtCOM1? (6) Hat AtCOM1 eine Funktion in somatischen Pflanzengeweben? (7) Welchen regulatorischen Modifikationen unterliegt das AtCOM1 Protein?

Das vom FWF geförderte Projekt "Charakterisierung von COM1/SAE2 in Arabidopsis thaliana" (P19307-B12) wurde von Peter Schlögelhofer und seinen Mitarbeitern umgesetzt (Universität Wien, Max F. Perutz Laboratories). Ziel des Projekts war die Charakterisierung eines neuen Pflanzenproteins, AtCOM1 (A. thaliana completion of meiosis 1), welches eine essentielle Rolle in der Meiose spielt. Fehlt dieses wichtige Protein können keine lebensfähigen Geschlechtszellen und somit keine Nachkommen entstehen. Die Meiose ist eine spezielle Zellteilung die essentiell für die Bildung von Pollen und Eizellen, den ausdifferenzierten pflanzlichen Geschlechtszellen, ist. Die zwei aufeinanderfolgenden Teilungen bedingen, nach erfolgter prä-meiotischer DNA Replikation, dass das Genom halbiert wird. Diploide Organismen wie Arabidopsis, (oder der Mensch) bilden haploide Geschlechtszellen. Bei einer später erfolgenden Befruchtung werden zwei Geschlechtszellen vereint und der daraus erwachsende neue Organismus hat wieder einen doppelten (diploiden) Chromosomensatz. Die Meiose dient aber auch der Durchmischung genetischer Information. In der ersten meiotischen Teilung werden die Chromosomen, durch streng kontrollierte zelluläre Werkzeuge, geschnitten und anschließend wieder verbunden, allerdings so, dass nunmehr diese neu geformten Chromosomen einzigartige Kombinationen der ursprünglichen darstellen. AtCOM1 ist eines jener molekularen Werkzeuge, das die Reparatur der Chromosomenbrüche vermittelt. In einer bioinformatischen Suche haben wir im Genom der Modellpflanze Arabidopsis thaliana eine entfernt verwandte Sequenz des Hefegens Com1 gefunden. Danach habe wir korrespondierende Mutantenpflanzen im Detail untersucht und den meiotischen Defekt der zu Sterilität führt (und auch somatische Defekte in DNA Reparatur) charakterisiert. Wir konnten zeigen, dass in den Pflanzen Com1 die selben Vorgänge wie in der Hefe unterstützt. Unsere Erkenntnisse haben mitgeholfen, die Com1 Genfamilie in höheren Eukaryonten ("CtIP") zu etablieren, und somit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis meiotischer und somatischer DNA Reparatur zu leisten. Das Forschungsprojekt ist nunmehr zwar offiziell abgeschlossen und die wichtigsten Erkenntnisse wurden publiziert, es stehen aber noch zwei weitere Publikationen aus, welche die transkriptionelle und post- transkriptionelle Kontrolle von AtCOM1 im Detail beschreiben werden. Weiters haben die Erkenntnisse und Vorarbeiten die in der Zeit des geförderten Projekts geleistet wurden, dazu beigetragen die Basis für zwei weitere Projekte zu legen. Einerseits sind wir im Begriff alle Zielproteine (darunter auch AtCOM1) die von den DNA Reparaturkinasen ATM und ATR phosphoryliert werden, zu identifizieren. Andererseits nutzen wir die Atcom1 Mutanten um ein Zwischenprodukt der meiotischen DNA Rekombination anzureichern, welches uns dann in weiterer Folge die Identifikation aller meiotischer DNA Doppelstrangbrüche (und damit indirekt Auskunft über Regionen des genetischen Austausches) erlauben wird.