Konstruktion von Chimera Baeyer-Villiger Biokatalysatoren

Oxygenasen katalysieren die chemo-, regio- und stereoselektive Inkorporation von molekularem Sauerstoff in organische Moleküle. Bedingt durch die Natur des Oxidationsmittels (O2 ) sowie die Abbaubarkeit von Enzymkatalysatoren repräsentiert dieser Ansatz eine grüne und nachhaltige Methodik für umweltfreundliche Oxidationsreaktionen. Die stereoselektive Baeyer-Villiger Oxidation von Ketonen zu den entsprechenden Lactonen ist ein prominentes Beispiel für die Überlegenheit von Enzymen als Katalysatorsysteme gegenüber artifiziellen Organometall-Katalysatoren, v.a. hinsichtlich ihrer Selektivität. Allerdings haben die Abhängigkeit von Kofaktoren und deren Recyclierung sowie die geringe Stabilität von Baeyer-Villiger Monooxygenasen (BVMOs) bislang eine weitere Verbreitung unter Synthesechemikern verhindert. Kürzlich konnten wir zeigen, dass Ganz-Zell-katalysierte Baeyer-Villiger Biooxidationen mit Hilfe rekombinanter Organismen durchgeführt werden können. Derartige mikrobilelle Expressionsstämme für die benötigten Enzyme sind einfach in der Handhabung und erlauben die Synthese chiraler Lactone als Schlüsselintermediate bei der Darstellung von Naturprodukten und bioaktiven Verbindungen im Gramm-Maßstab im Labor. Ziel dieses Projektes ist es, das letzte Hauptproblem bei der Anwendung von BVMOs im Routinelaborbetrieb durch die Entwicklung thermostabiler Chimera-Enzyme zu lösen. Derartige -BVMOs sollen aus der Verbindung eines thermostabilen Enzyms aus einem moderat thermophilen Organismus (PAMO) mit BVMOs bakteriellen Ursprungs hervorgehen. Da PAMO selbst lediglich ein sehr enges Substratprofil zeigt wodurch es zu einem ungeeigneten Kandidaten für einen umfassend anwendbaren Katalysator wird versprechen zahlreiche andere BVMOs mit breiter und gut beschriebener Substratakzeptanz höhere Erfolgsaussichten, v.a. da diese Enzyme auch die Darstellung enantiokomplementärer Produkte erlauben. Durch die Kombination von PAMO und bakteriellen BVMOs als Elterngeneration sollen neue -BVMOs entstehen, aus welchen in Hochdurchsatzverfahren mittels Fluorescenztests Kandidaten mit den gewünschten Eigenschaften ausgewählt werden. In einer zweiten Phase werden diese neuen Biokatalysatoren durch den Einsatz von Zufallsund rationaler Verfahren aus der Molekularbiologie weiter optimiert werden. Am Ende dieses Prozesses steht eine Palette von -BVMOs, welche die gewünschte breite ubstratakzeptanz und Selektivität mit verbesserter Thermostabilität verknüpfen. Dies wird zur Etablierung der chiralen Baeyer-Villiger Biooxidation als Methode in der enantioselectiven Synthese beitragen. Darüber hinaus können weitere Rückschlüsse auf jene Enzymregionen gezogen werden, die generell wesentlichen Beitrag an der Effizienz dieser Biocatalysatoren haben, und somit unser Verständnis dieser faszinierenden Enzymfamilie vertieft werden.

Biokatalyse bietet eine umweltverträgliche Alternative für "grüne" Oxidationsprozesse aufgrund der biologischen Verfügbarkeit und Abbaubarkeit der beteiligten Katalysatoren (Enzyme, Mikroorganismen). Biooxygenierungsreaktionen sind besonders wertvoll, zumal molekularer Sauerstoff als primäres Oxydans eingesetzt wird, welches leicht verfügbar und auch ökonomisch attraktiv ist. Allerdings stellt die geringe Stabilität von Oxygenasen unter Prozessbedingungen zusammen mit der Notwendigkeit, die biokatalytische Aktivität ständig an neue Substrate anpassen zu müssen, eine wesentliche Limitierung im Einsatz dieser Enzyme dar. Dieses Projekt zielte daher auf die Entwicklung von Lösungsstrategien für diese Schlüsselaspekte anhand der Untergruppen von Baeyer-Villiger Monooxygenasen (BVMOs), welche die namensgebende Reaktion in hoher Chemo-, Regio- und Stereoselektivität erlauben. Erfolge hinsichtlich einer möglichst vielseitigen Anwendbarkeit von BVMOs in der organischen Synthesechemie wurden in folgenden Bereichen erzielt: (i) Signifikante Verbesserung der Lager- und Reaktionsstabilität von BVMOs exemplarisch dargelegt an einem Modellvertreter. Dieser Projektteil erforderte tiefgreifende Veränderungen der Proteinstruktur sowie die Entwicklung von zuverlässigen Testmethoden. (ii) Erstellung von Substratprofilen für neue Wild-typ-Enzyme und Mutanten Bibliotheken zur Identifikation neuartiger Umsetzungen hinsichtlich Substratakzeptanz und Regioselektivität (insbes. anhand von bislang vernachlässigten Substratgruppen). (iii) Anwendung von BVMOs in neuartigen Biotransformationen in der Darstellung von neuen chiralen Bausteinen und Produkten. Eine Hauptstoßrichtigung des Projektes zielte auf die Identifikation von Schlüsselstrukturelementen des Peptidgerüstes zur Verbesserungen der thermischen Stabilität. Mehrere Ansätze wurden hierbei untersucht und schließlich führte eine wissensbasierte Strategie unter Nutzung von Konsenssequenzbereichen und Strukturinformationen aus Röntgendiffraktion zum Erfolg. Dieser Projektabschnitt erforderte darüber hinaus die Entwicklung und Validierung von geeigneten Testungsverfahren für das Enzym-Engineering. In einer parallelen Forschungsausrichtung wurden Anwendungen von Wild-typ und genetisch modifizierten BVMOs untersucht. Umfangreiche Substrateprofile von zwei neuen Wild-type BVMOs wurden erstellt und vergleichende Screenings hinsichtlich Stereoselektivität von zwei Mutantenbibliotheken wurden durchgeführt. Zusätzlich konnten zwei neue Anwendungsbereiche von BVMOs in der Synthesechemie erarbeitet werden, wonach ein neuartiger Zugang zu Duftstoffen sowie zu ß-Aminosäuren als wertvolle Zwischenstufen für pharmazeutische Produkte gelang.