Bam-ein neues Glucocorticoid-geregeltes BH3-Transkript

Apoptose, oder programmierter Zelltod, spielt eine wichtige Rolle in Zellphysiologie, Pathologie und Krebsbehandlung. Die Bcl-2 Familie pro- und anti-apoptotischer Molekule ist ein zentraler Apoptoseregulator, wobei die Unterfamile der "BH3-only" Moleküle als Aktivatoren und Verstärker des Zelltods fungiert. Glukokortikoid (GC) - induzierte Apoptose ist eine zentrale Komponent in der Therapie akuter lymphoblastischer Leukämien (ALL), und Aufklärung dieses Phänomens ist für die Entwicklung verbesserter Therapieansätze notwendig. Wir haben unlängst ein neues Transkript des BCL2L11/Bim Genlokus namens "Bam" entdeckt, das in 7 von 14 ALL-Patienten (13 Kindern, 1 Erwachsener) während GC-Monotherapie induziert war. In vitro wurde dieses Transcript durch GC translationsunabhängig induziert und könnte damit als direktes GC-Transkriptionstarget für die Leukämiezellapoptose in den betroffenen Patienten verantwortlich sein. Zudem könnte dieses neue BH3 Molekül auch in anderen Apoptosepathways eine Rolle spielen. Wir schlagen nun vor, zu untersuchen (1) ob Expression von Bam in ALL Zelllinien, ex vivo Zellen von Patienten und in nicht-lymphoiden Zellen Apoptose auslösen kann, (2) ob gentechnologische Verhinderung der Bam Induktion GC-induzierte Apoptose von ALL Zellen verhindert, (3) ob der Bam-Promoter GC Responsivität auf "Reportersysteme" übertragen kann, (4) wo Bam in der Zelle lokalisiert ist, and (5) ob Bam auch in Mäusen expremiert wird. Für diese Studien haben wir bereits geeignete lentivirale Expressionssysteme für geregelte Überexpression und Genausschaltung entwickelt (letzteres mit Hilfe der "RNA-Interferenz" Technologie). Die Promoterstudien werden mittels transienter Transfection von Wildtyp und mutierten Bam-Promoterkonstrukten durchgeführt. Für die Bam-Lokalisation werden wir "life cell" Mikroskopie verwenden, die sogenannte "RACE Technik" ("rapid amplification of cDNA ends") für den Nachweis von Bam-Transkripten in Mausthymozyten. Zusammenfassend sollte die Studie dieses neue BH3-only Molekül charakterisieren und seine mögliche Rolle in der GC-induzierten Leukämiezellapoptose aufklären.

Glucocorticoid (GC) - induzierte Apoptose ist ein zentraler Bestandteil der Therapie akuter lymphoblastischer Leukämien (ALL). Aufklärung der Mechanismen dieses Phänomens sind essentiell für verbesserte Therapieansätze. GC wirken über den GC-Rezeptor, einen Ligand-aktivierter Transkriptionsfaktor aus der Kernrezeptorfamilie. Dementsprechend werden die meisten GC-Effekte über Veränderungen der Genexpression vermittelt, wobei unklar ist, welche Gene für die GC-induzierte Apoptose verantwortlich sind. Im Zuge einer ausgedehn-ten "expression profiling" Analyse von experimentellen Systemen und Lymphoblasten von Kindern mit ALL unter systemischer GC-Monotherapie beobachteten wir, dass "Bam", ein vorhergesagtes 2 Exon-Gen im BCL2L11/Bim Lokus, bei zahlreichen Kindern durch GC induziert war. Der Bim Lokus kodiert für ein wichtiges "Killer" Protein vom "BH3- only" Typ aus der BCL2 Familie. Da das vorhergesagte Bam Protein die gleiche BH3 Killerdomäne trägt wie Bim, schlugen wir vor, dieses Gen/Protein näher zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass Bam-mRNA in lymphoiden Leukemiezellen gebildet aber praktisch nicht in Protein übersetzt wird, was wir auf das Fehlen einer typischen Translationsstart-sequenz und die Gegenwart mehrerer "out of frame" Startkodonen in der 5`untranslatierten Region zurück führen konnten. Damit scheidet Bam als wichtiger Mediator des GC-induzierten Zelltodes praktisch aus. Wir entdeckten aber ein neues, alternatives Bim Transkript, welches die Bim 5` Region mit der Bam 3`Region verbindet. Dadurch entsteht ein vorhergesagtes Protein mit denselben N-terminalen Aminosäuren wie Bim (inklusive der BH3 Domäne) aber einem völlig anderen C-Terminus. Wir zeigen, dass dieses neue Transkript (genannt Bimbam) - so wie auch Bim selbst - in 3 splice Varianten vorkommt, nämlich BimbamEL, L und S (extra long, long und short) und dass es in ein Protein mit ähnlichem "killing" Potential wie Bim translatiert wird. Das war überraschend, da die beiden Proteine komplett unterschiedliche C-Termini aufweisen, diese aber für mitochondriale Lokalisation and Apoptoseauslösung verantwortlich sind. Wir fanden, dass Bimbam sowohl an Mitochondrien als auch an andere zytoplasmatische Membranen (wie die des endoplasmatischen Reticulum) bindet und liefern Evidenzen, dass diese Lokalisation über die BH3 Domäne abläuft, die mit der anderer BCL2 Proteine (die an diesen Membranen sitzen) interagiert. Im Gegensatz dazu lokalisiert Bim über seinen C-Terminus vornehmlich an mitochondriale Membranen. Diese Befunde lassen vermuten, dass Bim und Bimbam über zwei verschiedene Mechanismen wirken. Da kommerziell erhältliche Antikörper nicht zwischen Bim und Bimbam unterscheiden können, könnten verschiedene Effekte, die bisher Bim zugeschrieben wurden, in Wirklichkeit das Ergebnis von Bimbam sein. Was noch gezeigt werden muss ist, welchen quantitativen Anteil Bimbam an GC- induzierten oder anderen Zelltodformen einnimmt.