Intrazelluläre PCI-Partner

Protein C Inhibitor (PCI) ist ein unspezifischer Proteaseinhibitor, der zur Familie der Serpine gehört. Beim Menschen wird PCI in einer Vielzahl von Organen und Geweben exprimiert und kommt in sehr vielen Körperflüssigkeiten vor. PCI hemmt intravaskuläre Proteasen, wie Faktoren des Gerinnungs- und des fibrinolytischen Systems, aber auch extravaskuläre Proteasen wie Gewebekallikrein oder die Spermienprotease Acrosin. Die physiologische Bedeutung des PCI ist bislang ungeklärt. Unserer Gruppe ist es vor kurzem gelungen, in Mäusen das PCI Gen durch homologe Rekombination zu inaktivieren. Die mit dieser Methode hergestellten homozygoten PCI-/- Männchen waren unfruchtbar aufgrund einer gestörten Spermatogenese bei zerstörter Blut- Hoden-Schranke. Homozygote Weibchen und heterozygote Tiere zeigten normale Fortpflanzungsfähigkeit. Ansonsten schienen die Tiere äußerlich normal, was nicht verwunderlich ist, da in der Maus - anders als beim Menschen - PCI fast ausschließlich im Reproduktionstrakt exprimiert wird. Wir konnten allerdings in noch nicht publizierten Untersuchungen feststellen, daß in Maus-Embryos PCI in vielen Organen in ganz bestimmten Entwicklungsphasen exprimiert wird, was für eine Rolle in der Organentwicklung spricht. Eigene jüngste Untersuchungen ergaben außerdem, daß PCI nicht nur extrazellulär vorkommt, sondern auch intrazellulär, und zwar in den Kernen von Leukozyten. Genauere Untersuchungen zeigten ferner, daß PCI von diesen Zellen aus der Umgebung aufgenommen werden kann und dann in den Kern transloziert wird. Die Funktion von intrazellulärem/intranukleärem PCI ist bislang unklar, genauso wie die Mechanismen der Internalisierung und der Translokation in den Kern. Diese Fragestellungen werden daher zur Zeit von unserer Forschungsgruppe untersucht. Im Rahmen des vorliegenden Projektes sollen intrazelluläre Reaktionspartner von PCI identifiziert und charakterisiert werden. Es sollen dabei in erster Linie Proteine gefunden werden, die entweder an der Zellmembran, im Zytoplasma oder im Zellkern PCI binden. Als Methoden sollen unter anderen "Yeast two-hybrid Screening", Co-Immunpräzipitation sowie Protein-Cross-linking zur Anwendung kommen. Im Anschluß an die Identifizierung von PCI-Reaktionspartnern soll die Bedeutung der Wechselwirkung von PCI mit diesen Proteinen für die Zellfunktion analysiert werden. Als Ergebnis unserer Untersuchungen, die parallel zu anderen Untersuchungen betreffend den Mechanismus der Internalisierung und der Kerntranslokation durchgeführt werden, erwarten wir wesentliche neue Erkenntnisse hinsichtlich der Funktion von intrazellulärem Protein C Inhibitor.

In früheren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass der sezernierte, extrazelluläre Proteaseinhibitor Protein C Inhibitor (PCI) über einen unkonventionellen Mechanismus unter Beteiligung das Phospholipids Phosphatidyläthanolamin von Zellen internalisiert und in den Zellkern transloziert werden kann. Ziel des Projektes P17337-B09 war es, intrazelluläre oder zellmembranständige Proteine zu identifizieren, die mit PCI interagieren. Unter Zuhilfenahme verschiedener methodische Ansätze (z.B. yeast-two-hybrid screening, subzelluläüre Fraktionierung, Co-Immunpräzipitation) ist es uns gelungen, eine Reihe von Proteinen zu identifizieren, die mit PCI interagieren. Die Interaktion von PCI mit einem dieser Proteine, nämlich JFC1 (synaptotagmin-like 1), wurde genauer untersucht. JFC1 wurde ursprünglich als Reaktionspartner eines Proteins aus dem NADPH-Oxidase Komplex, nämlich p67phox, entdeckt. JFC1 bindet an Phospholipide und gehört zu den Effektormolekülen der kleinen GTPase Rab27a, welche an diversen vesikulären Transportprozessen in der Zelle beteiligt ist. Mittels yeast-two-hybrid screening konnten wir JFC1 als PCI-bindendes Protein identifizieren. Wir konnten diese Wechselwirkung zwischen PCI und JFC1 durch Co-Immunpräzipitation bestätigen und zwar nicht nur in Systemen, in welchen die beiden Proteine in transfizierten Zellen überexprimiert waren, sondern auch mit den endogen von Zellen synthetisierten Proteinen. Bei den verwendeten Zellen handelte es sich einerseits um Leukozyten und andererseits um Prostata-Zelle. Außerdem konnten wir mittels konfokaler Mikroskopie in immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen zeigen, dass PCI und JFC1 im Bereich der Zellmembran kolokalisiert sind. Da JFC1 ursprünglich als Interaktionspartner eines Proteins des NADPH-Oxidase-Komplexes entdeckt wurde, untersuchten wir die Auswirkung einer vermehrten Synthese von PCI und/oder JFC1 auf die NADPH-Oxidase Aktivität in Leukozyten. Jedes der beiden Proteine führte zu einem Absinken der NADPH-Oxidase Aktivität. Wurden beide gemeinsam überexprimiert, kam es jedoch zu keinem zusätzlichen Effekt. Daher sind weitere Untersuchungen notwendig, um die biologische Bedeutung der Wechselwirkung von PCI und JFC1 zu verstehen.