Aquaporine, Wassertransport und Pollenschlauchwachstum

In Samenpflanzen transportieren wachsende Pollenschläuche während der Befruchtung die Spermienzellen von der Narbe durch das Griffelgewebe zu den Samenanlagen. Pollenschläuche sind die am schnellsten wachsenden Pflanzenzellen und eine hohe Wasseraufnahmerate ist für das schnell zunehmende Zellvolumen erforderlich. Der Transport von Wasser über die Plasmamembran der vegetativen Zelle eines Pollenkorns ist während drei Stadien besonders wichtig: 1. das reife, dehydrierte Pollenkorn muss, nachdem es auf die Narbe gefallen ist, Wasser aufnehmen, 2. der Zellturgordruck muss über Wasseraufnahme und -abgabe reguliert werden und 3. die Aufnahme von Wasser ermöglicht während des Pollenschlauchwachstums die Zunahme des Zellvolumens. Diese Wasseraufnahme ist bisher ungeklärt und somit sind die Modellvorstellungen zum Pollenschlauchwachstum in Bezug auf den Wassertransport oftmals reine Spekulationen. In diesem Projekt soll mit Hilfe einer intrazellulären Druckmesssonde und eines osmotischen Schwelltests der Wassertransport über die Plasmamembran von Pollenkörnern und -schläuchen untersucht werden. Als Untersuchungsobjekte werden Pollenkörner von Lilium longiflorum, einem Modellorganismus der Pollenphysiologie, verwendet. Die quantitative Bestimmung der Wasserpermeabilität (Pw) der Plasmamembran und eine Hemmung mittels Quecksilberverbindungen lässt Rückschlüsse zu, ob der Wassertransport durch die Lipiddoppelschicht der Membran oder mittels spezieller Wasserkanäle, den Aquaporinen, erfolgt. Eventuell im Pollen vorhandene Aquaporine sollen mit Hilfe molekularbiologischer Methoden identifiziert, kloniert und sequenziert werden. Dazu wird eine cDNA-Bibliothek aus Lilienpollenkörnern und -schläuchen erstellt und diese mit einer Aquaporin-spezifischen Sonde abgesucht. Die Wassertransporteigenschaften der identifizierten Aquaporine werden durch Injektion der entsprechenden mRNA in Xenopus Oozyten und in transient transformierten Pollenprotoplasten mittels osmotischen Schwelltests überprüft. Um die physiologische Funktion der identifizierten Aquaporine zu untersuchen, werden Keimungsrate und Schlauchwachstumsrate von transformierten Pollenkörnern bestimmt, indem die jeweiligen Aquaporine überexprimiert werden oder bei denen die Expression unterdrückt ist (RNAi-Technik). Parallel dazu wird der Wassertransport mittels osmotischen Schwelltests in den unterschiedlich transformierten Pollen gemessen. Mit Hilfe von Einzelzellmessungen lässt sich eine mögliche Korrelation zwischen der Transkription eines Aquaporins und seiner Aktivität durch einen kombinierten Schwelltest und Einzelzell-RT-PCR untersuchen, sodass der Beitrag verschiedener Aquaporine zur Wasseraufnahme während der Keimung und des Schlauchwachstums bestimmt werden kann.

In Samenpflanzen transportieren wachsende Pollenschläuche während der Befruchtung die Spermienzellen von der Narbe durch das Griffelgewebe zu den Samenanlagen. Pollenschläuche sind die am schnellsten wachsenden Pflanzenzellen und eine hohe Wasseraufnahmerate ist für das schnell zunehmende Zellvolumen erforderlich. Der Transport von Wasser über die Plasmamembran der vegetativen Zelle eines Pollenkorns ist während drei Stadien besonders wichtig: 1. das reife, dehydrierte Pollenkorn muss, nachdem es auf die Narbe gefallen ist, Wasser aufnehmen, 2. der Zellturgordruck muss über Wasseraufnahme und -abgabe reguliert werden und 3. die Aufnahme von Wasser ermöglicht während des Pollenschlauchwachstums die Zunahme des Zellvolumens. Diese Wasseraufnahme ist bisher ungeklärt und somit sind die Modellvorstellungen zum Pollenschlauchwachstum in Bezug auf den Wassertransport oftmals reine Spekulationen. In diesem Projekt soll mit Hilfe einer intrazellulären Druckmesssonde und eines osmotischen Schwelltests der Wassertransport über die Plasmamembran von Pollenkörnern und -schläuchen untersucht werden. Als Untersuchungsobjekte werden Pollenkörner von Lilium longiflorum, einem Modellorganismus der Pollenphysiologie, verwendet. Die quantitative Bestimmung der Wasserpermeabilität (Pw) der Plasmamembran und eine Hemmung mittels Quecksilberverbindungen lässt Rückschlüsse zu, ob der Wassertransport durch die Lipiddoppelschicht der Membran oder mittels spezieller Wasserkanäle, den Aquaporinen, erfolgt. Eventuell im Pollen vorhandene Aquaporine sollen mit Hilfe molekularbiologischer Methoden identifiziert, kloniert und sequenziert werden. Dazu wird eine cDNA-Bibliothek aus Lilienpollenkörnern und -schläuchen erstellt und diese mit einer Aquaporin-spezifischen Sonde abgesucht. Die Wassertransporteigenschaften der identifizierten Aquaporine werden durch Injektion der entsprechenden mRNA in Xenopus Oozyten und in transient transformierten Pollenprotoplasten mittels osmotischen Schwelltests überprüft. Um die physiologische Funktion der identifizierten Aquaporine zu untersuchen, werden Keimungsrate und Schlauchwachstumsrate von transformierten Pollenkörnern bestimmt, indem die jeweiligen Aquaporine überexprimiert werden oder bei denen die Expression unterdrückt ist (RNAi-Technik). Parallel dazu wird der Wassertransport mittels osmotischen Schwelltests in den unterschiedlich transformierten Pollen gemessen. Mit Hilfe von Einzelzellmessungen lässt sich eine mögliche Korrelation zwischen der Transkription eines Aquaporins und seiner Aktivität durch einen kombinierten Schwelltest und Einzelzell-RT-PCR untersuchen, sodass der Beitrag verschiedener Aquaporine zur Wasseraufnahme während der Keimung und des Schlauchwachstums bestimmt werden kann.