Bedeutung von Tlk1/pK90 in der zellulären Strahlenantwort

Eine der Möglichkeiten, die Effizienz der Strahlentherapie in der Behandlung maligner Erkrankungen zu erhöhen, liegt in einer pharmakologischen Intervention mit dem Ziel die Strahlensensitivität von Tumorzellen zu erhöhen oder die Strahlenempfindlichkeit von Normalgewebszellen zu reduzieren. Die zelluläre Strahlensensitivität hängt in großem Ausmaß von intra- und extra-zellulären Signalen sowie von der Weiterleitung und Integration dieser ab. Die Weiterleitung und Integration dieser Signale wird durch intrazellulären Signalübertragungs-kaskaden bewirkt. Deshalb stellt die Untersuchung von strahlenbiologisch relevanten Signalübertragungskaskaden einen wichtigen ersten Schritt in der Identifikation von therapeutisch interessanten Proteinen dar. Unter Verwendung eines in-Gel renaturierungs Assays haben wir eine bisher nicht beschriebene Proteinkinaseaktivität in der humanen Zelllinie HL-60 identifiziert, die Minuten nach Einwirkung ionisierender Strahlung inhibiert wird. Da diese Aktivität bei einem Molekulargewicht von 90 kDa auftritt, wurde sie von uns pK90 genannt. Weitere Untersuchungen erbrachten, daß es sich bei pK90 um eine Serin/Threonin - Kinase des Zellkerns handelt. Die Aktivität von pK90 wird über Phosphorylierung geregelt und intrazellulär findet sich pK90 ausschließlich in einem multiprotein Komplex mit einem Molekulargewicht von 450 kDa. In weitere Folge gelang es mittels Säulen-chromatographie pK90 zu reinigen. Eine massenspektrometrische Untersuchung des gereinigten zeigte, daß pK90 ident ist mit der proteinkinase Tlk1. Gleichzeitig zeigte eine andere Arbeitsgruppe, daß Tlk1 ein Substrat von Chk1 ist und daß die Modulation der Tlk1 Aktivität ein funktionelles ATM sowie NBS1 Protein voraussetzt. Es ist deshalb das Ziel dieses Projektes die Rolle von Tlk1/pK90 in der zellulären Reaktion auf ionisierende Strahlung zu untersuchen. Hierzu ist vorgesehen, die Aktivität von Tlk1/pK90 über mehrere experimentelle Strategien, wie geregelte und ungeregelte transgene Überexpression, siRNA Techniken sowie durch Konstruktion einer trandomiant-negativen Tlk1 Mutante exogen zu beeinflussen. Außerdem ist geplant neue Substrate von Tlk1/pK90 zu identifizieren, die übrigen Proteine im 450 kDa Komplex zu identifizieren und nach Phosatasen zu suchen, die ein Rolle in der Modulation der Tlk1/pK90 Aktivität spielen. Insgesamt wird das Projekt Tlk1/pK90 in einem Ausmaß charakterisieren, das es erlaubt abzuschätzen ob die Kinase ein interessantes und effektives Zielprotein für eine mögliche pharmakologische Intervention mit dem Ziel eine Modulation der zellulären Strahlensensitivität darstellt.

Eine der Möglichkeiten, die Effizienz der Strahlentherapie in der Behandlung maligner Erkrankungen zu erhöhen, liegt in einer pharmakologischen Intervention mit dem Ziel die Strahlensensitivität von Tumorzellen zu erhöhen oder die Strahlenempfindlichkeit von Normalgewebszellen zu reduzieren. Die zelluläre Strahlensensitivität hängt in großem Ausmaß von intra- und extra-zellulären Signalen sowie von der Weiterleitung und Integration dieser ab. Die Weiterleitung und Integration dieser Signale wird durch intrazellulären Signalübertragungs-kaskaden bewirkt. Deshalb stellt die Untersuchung von strahlenbiologisch relevanten Signalübertragungskaskaden einen wichtigen ersten Schritt in der Identifikation von therapeutisch interessanten Proteinen dar. Unter Verwendung eines in-Gel renaturierungs Assays haben wir eine bisher nicht beschriebene Proteinkinaseaktivität in der humanen Zelllinie HL-60 identifiziert, die Minuten nach Einwirkung ionisierender Strahlung inhibiert wird. Da diese Aktivität bei einem Molekulargewicht von 90 kDa auftritt, wurde sie von uns pK90 genannt. Weitere Untersuchungen erbrachten, daß es sich bei pK90 um eine Serin/Threonin - Kinase des Zellkerns handelt. Die Aktivität von pK90 wird über Phosphorylierung geregelt und intrazellulär findet sich pK90 ausschließlich in einem multiprotein Komplex mit einem Molekulargewicht von 450 kDa. In weitere Folge gelang es mittels Säulen-chromatographie pK90 zu reinigen. Eine massenspektrometrische Untersuchung des gereinigten zeigte, daß pK90 ident ist mit der proteinkinase Tlk1. Gleichzeitig zeigte eine andere Arbeitsgruppe, daß Tlk1 ein Substrat von Chk1 ist und daß die Modulation der Tlk1 Aktivität ein funktionelles ATM sowie NBS1 Protein voraussetzt. Es ist deshalb das Ziel dieses Projektes die Rolle von Tlk1/pK90 in der zellulären Reaktion auf ionisierende Strahlung zu untersuchen. Hierzu ist vorgesehen, die Aktivität von Tlk1/pK90 über mehrere experimentelle Strategien, wie geregelte und ungeregelte transgene Überexpression, siRNA Techniken sowie durch Konstruktion einer trandomiant-negativen Tlk1 Mutante exogen zu beeinflussen. Außerdem ist geplant neue Substrate von Tlk1/pK90 zu identifizieren, die übrigen Proteine im 450 kDa Komplex zu identifizieren und nach Phosatasen zu suchen, die ein Rolle in der Modulation der Tlk1/pK90 Aktivität spielen. Insgesamt wird das Projekt Tlk1/pK90 in einem Ausmaß charakterisieren, das es erlaubt abzuschätzen ob die Kinase ein interessantes und effektives Zielprotein für eine mögliche pharmakologische Intervention mit dem Ziel eine Modulation der zellulären Strahlensensitivität darstellt.