Molekulare Interaktionen für die Nanobiotechnologie

Viele Bakterien und Archaea weisen kristalline Zellwandschichten (S-Schichten) als ihre äußerste Zellwandkomponente auf. Aufgrund der intrinsischen Eigenschaft von S-Schicht-Proteinen in monomolekulare Proteingitter zu assemblieren, wurden sie zur Herstellung von S-Schicht-Fusionsproteinen herangezogen. Um eine Kristallisation auf festen Trägern zu erzielen, wurden diese mit sekundärem Zellwandpolymer (SCWP), dem natürlichen Ankermolekül von S-Schicht-Proteinen in der Zellwand, vorbeschichtet. Bis jetzt wurden die chimären Gene, die S-Schicht-Fusionsproteine kodieren, in Escherichia coli exprimiert. Um Probleme, die im Falle eines gram-negativen Expressionssystems auftreten können, zu vermeiden, soll ein homologes Expressions-system in Bacillus sphaericus CCM 2177 etabliert werden, indem das chromosomale S-Schicht-Gen sbpA inaktiviert und durch die Sequenz, die ein S-Schicht-Fusionsprotein kodiert, ersetzt wird. Der Bindunsmechanismus zwischen S- Schicht-Homologen (SLH)-Domänen und pyruvathältigen Zellwandpolymeren ist unter Bakterien weit verbreitet. Im Falle des S-Schicht-Proteins SbpA reicht die SLH-Domäne allerdings nicht zur Bindung an das SCWP aus, sodass nach einer weiteren Sequenz oder Domäne zur Ausbildung der funktionellen SCWP-bindenden Domäne gesucht wird. Aus diesem Grund sollen Sequenzen, die C-terminal verkürzte rSbpA-Formen kodieren, homolog in B. sphaericus CCM 2177 exprimiert, und die Bindung dieser rSbpA Formen an das SCWP mittels Surface Plasmon Resonanz (SPR) Technik untersucht werden. Die Identifikation der an der Bindung involvierten Aminosäuren soll mittels Punktmutationen und SPR Messungen erfolgen. Um die Bedeutung der Pyruvatreste im SCWP für die Bindung von anderen zellwandassoziierten Exoproteinen als S-Schicht-Proteinen aufzuklären, sollen vergleichende Untersuchungen an dem Wildtypstamm von B. sphaericus CCM 2177 und einer Defektmutante, in der das Gen, das zur Einführung der Pyruvatreste in das SCWP erforderlich ist, deletiert wurde, durchgeführt werden. Domänen, die für die Bindung an das SCWP essentiell sind, sollen mittels N- oder C-terminal verkürzter Formen von ausgewählten Exoproteinen und SPR Messungen identifiziert werden. Das Vorhandensein eines zweiten, ebenfalls konservierten Bindungsmechanismus zwischen S-Schicht-Proteinen oder anderen Exoproteinen, die keine SLH- Domäne aufweisen, und (N-Acetyl)mannosaminuronsäurehältigen SCWPs soll untersucht werden. Darüberhinaus sollen Domänen einer Exoamylase, die an die S-Schicht und die rigide Zellwandschicht von Geobacillus stearothermophilus ATCC 12980 binden, identifiziert werden. Die Erkenntnisse bezüglich der molekularen Wechselwirkungen zwischen zellwandassoziierten Exoproteinen und Zellwandpolymeren soll zur Konstruktion neuartiger Fusionproteine, die als "patterning elements" in der Nanobiotechnologie Anwendung finden könnten, herangezogen werden.

Viele Bakterien und Archaea weisen kristalline Zellwandschichten (S-Schichten) als ihre äußerste Zellwandkomponente auf. Aufgrund der intrinsischen Eigenschaft von S-Schicht-Proteinen in monomolekulare Proteingitter zu assemblieren, wurden sie zur Herstellung von S-Schicht-Fusionsproteinen herangezogen. Um eine Kristallisation auf festen Trägern zu erzielen, wurden diese mit sekundärem Zellwandpolymer (SCWP), dem natürlichen Ankermolekül von S-Schicht-Proteinen in der Zellwand, vorbeschichtet. Bis jetzt wurden die chimären Gene, die S-Schicht-Fusionsproteine kodieren, in Escherichia coli exprimiert. Um Probleme, die im Falle eines gram-negativen Expressionssystems auftreten können, zu vermeiden, soll ein homologes Expressions-system in Bacillus sphaericus CCM 2177 etabliert werden, indem das chromosomale S-Schicht-Gen sbpA inaktiviert und durch die Sequenz, die ein S-Schicht-Fusionsprotein kodiert, ersetzt wird. Der Bindunsmechanismus zwischen S- Schicht-Homologen (SLH)-Domänen und pyruvathältigen Zellwandpolymeren ist unter Bakterien weit verbreitet. Im Falle des S-Schicht-Proteins SbpA reicht die SLH-Domäne allerdings nicht zur Bindung an das SCWP aus, sodass nach einer weiteren Sequenz oder Domäne zur Ausbildung der funktionellen SCWP-bindenden Domäne gesucht wird. Aus diesem Grund sollen Sequenzen, die C-terminal verkürzte rSbpA-Formen kodieren, homolog in B. sphaericus CCM 2177 exprimiert, und die Bindung dieser rSbpA Formen an das SCWP mittels Surface Plasmon Resonanz (SPR) Technik untersucht werden. Die Identifikation der an der Bindung involvierten Aminosäuren soll mittels Punktmutationen und SPR Messungen erfolgen. Um die Bedeutung der Pyruvatreste im SCWP für die Bindung von anderen zellwandassoziierten Exoproteinen als S-Schicht-Proteinen aufzuklären, sollen vergleichende Untersuchungen an dem Wildtypstamm von B. sphaericus CCM 2177 und einer Defektmutante, in der das Gen, das zur Einführung der Pyruvatreste in das SCWP erforderlich ist, deletiert wurde, durchgeführt werden. Domänen, die für die Bindung an das SCWP essentiell sind, sollen mittels N- oder C-terminal verkürzter Formen von ausgewählten Exoproteinen und SPR Messungen identifiziert werden. Das Vorhandensein eines zweiten, ebenfalls konservierten Bindungsmechanismus zwischen S-Schicht-Proteinen oder anderen Exoproteinen, die keine SLH- Domäne aufweisen, und (N-Acetyl)mannosaminuronsäurehältigen SCWPs soll untersucht werden. Darüberhinaus sollen Domänen einer Exoamylase, die an die S-Schicht und die rigide Zellwandschicht von Geobacillus stearothermophilus ATCC 12980 binden, identifiziert werden. Die Erkenntnisse bezüglich der molekularen Wechselwirkungen zwischen zellwandassoziierten Exoproteinen und Zellwandpolymeren soll zur Konstruktion neuartiger Fusionproteine, die als "patterning elements" in der Nanobiotechnologie Anwendung finden könnten, herangezogen werden.