Struktur und Funktion von ribosomalen Protein-RNA-Komplexen

Im Rahmen zweier Vorläufer-Projekte, die sich hauptsächlich mit der Regulation der Synthese ribosomaler Proteine in Archaea (früher als Archaebakterien bezeichnet) und der Wechsel-wirkungen dieser Proteine mit ihren spezifischen Bindestellen auf der rRNA und mRNA beschäftigten, konnten wir zeigen, dass die Affinität der ribosomalen Proteine L1, S8 und L10/L12(4) aus (hyper)thermophilen Archaea und Bakterien für die spezifischen rRNA-Bindestellen 10- bis 100-fach höher ist als die der homologen Proteine aus eng verwandten mesophilen Arten. Im Rahmen des neuen Projekts wollen wir diese Untersuchungen fortführen. Die Hauptziele sind: - die Kristallisation von L10/12(4) im Komplex mit 23S rRNA aus einem Archaeon und einem Bakterium zur Strukturaufklärung (in Zusammenarbeit mit einer russischen Arbeitsgruppe). Damit wäre die letzte Lücke in der Struktur des Ribosoms geschlossen. - die Kristallisation (und anschließende Strukturaufklärung) des regulatorischen L1-mRNA-Komplexes aus dem Archaeon Methanococcus, um, in Verbindung mit weiteren Experimenten, den Mechanismus dieses neuen Typus der translationellen Autoregulation aufzuklären. - die Identifizierung der Strukturelemente (Aminosäuren) der Proteine S8 und L1, die die hohe bzw. niedrige Affinität für die spez. RNA-Bindestelle, und, für L1, die Spezifität der Bindung definieren. Dazu ist geplant, MjaL1 und MjaS8 (beide binden rRNA mit sehr hoher Affinität) schrittweise durch Austausch von Aminosäuren in Proteine zu überführen, die die spez. rRNA-Bindestelle mit niedriger Affinität binden. - die Untersuchung der Rolle von stark bzw. schwach bindenden ribosomalen Proteinen S8, L1 und L10/L12(4) auf die Funktion des gesamten Ribosoms. Dazu werden wir Hybrid-Ribosmen konstruieren, bestehend aus E. coli 50S bzw 30S Untereinheiten, beiden L1, S8 bzw. L10/L12(4) durch die entsprechenden Proteine ersetzt sind, die mit wesentlich höherer Affinität binden. Unsere Untersuchungen sollen zum generellen Verständnis von RNA-Protein-Wechselwirkungen beitragen. Der Vergleich von Strukturdaten mit funktionellen Daten wird zeigen, wie RNA-bindende Proteine ihre Affinität für die spezifischen RNA-Bindestellen modulieren.

Im Rahmen zweier Vorläufer-Projekte, die sich hauptsächlich mit der Regulation der Synthese ribosomaler Proteine in Archaea (früher als Archaebakterien bezeichnet) und der Wechsel-wirkungen dieser Proteine mit ihren spezifischen Bindestellen auf der rRNA und mRNA beschäftigten, konnten wir zeigen, dass die Affinität der ribosomalen Proteine L1, S8 und L10/L12(4) aus (hyper)thermophilen Archaea und Bakterien für die spezifischen rRNA-Bindestellen 10- bis 100-fach höher ist als die der homologen Proteine aus eng verwandten mesophilen Arten. Im Rahmen des neuen Projekts wollen wir diese Untersuchungen fortführen. Die Hauptziele sind: die Kristallisation von L10/12(4) im Komplex mit 23S rRNA aus einem Archaeon und einem Bakterium zur Strukturaufklärung (in Zusammenarbeit mit einer russischen Arbeitsgruppe). Damit wäre die letzte Lücke in der Struktur des Ribosoms geschlossen. die Kristallisation (und anschließende Strukturaufklärung) des regulatorischen L1-mRNA-Komplexes aus dem Archaeon Methanococcus, um, in Verbindung mit weiteren Experimenten, den Mechanismus dieses neuen Typus der translationellen Autoregulation aufzuklären. die Identifizierung der Strukturelemente (Aminosäuren) der Proteine S8 und L1, die die hohe bzw. niedrige Affinität für die spez. RNA-Bindestelle, und, für L1, die Spezifität der Bindung definieren. Dazu ist geplant, MjaL1 und MjaS8 (beide binden rRNA mit sehr hoher Affinität) schrittweise durch Austausch von Aminosäuren in Proteine zu überführen, die die spez. rRNA-Bindestelle mit niedriger Affinität binden. die Untersuchung der Rolle von stark bzw. schwach bindenden ribosomalen Proteinen S8, L1 und L10/L12(4) auf die Funktion des gesamten Ribosoms. Dazu werden wir Hybrid-Ribosmen konstruieren, bestehend aus E. coli 50S bzw 30S Untereinheiten, beiden L1, S8 bzw. L10/L12(4) durch die entsprechenden Proteine ersetzt sind, die mit wesentlich höherer Affinität binden. Unsere Untersuchungen sollen zum generellen Verständnis von RNA-Protein-Wechselwirkungen beitragen. Der Vergleich von Strukturdaten mit funktionellen Daten wird zeigen, wie RNA-bindende Proteine ihre Affinität für die spezifischen RNA-Bindestellen modulieren.