Struktur und Molekularer Mechanismus von Hydroxynitrillyasen

Hydroxynitrillyasen (HNLs) katalysieren die Cyanhydrinreaktion, d.h. die reversible Spaltung von a-Cyanhydrinen zu Blausäure und dem entsprechenden Aldehyd oder Keton. In ihrer biologischen Funktion sind sie Teil eines pflanzlichen Abwehrsystems, welches auf der Toxizität der Blausäure beruht. HNLs zeigen eine große natürliche Diversität, d.h. mehrere verschiedene HNLs sind entstanden durch konvergente Evolution aus Vorgängermolekülen, die zu völlig verschiednen Protein-Superfamilien gehören. Die sehr unterschiedlichen Architekturen der aktiven Stellen in diesen nicht verwandten Enzymen liefert Einblicke in die strukturellen Voraussetzungen für die Katalyse der Cyanhydrinspaltung. HNLs werden zur Zeit als industrielle Biokatalysatoren für die enantioselektive Synthese chiraler Cyanhydrine in einem Umfang von mehreren 100 Jahrestonnen verwendet. Als Folge der großen natürlichen Vielfalt der Hydroxynitrillyasen sind Enzyme sowohl mit (R) als auch mit (S) Enantioselektivität verfügbar. 3D-Strukturdaten (zu einem beträchtlichen Teil aus dem Labor des Antragstellers) sind zur Zeit verfügbar für drei Typen von HNL: solchen, die mit a/ß-Hydrolasen, mit FAD-abhängigen Oxireduktasen und mit Carboxipeptidasen verwandt sind. Ein detaillierter molekularer Mechanismus wurde bislang aber nur für HNLs aus der Klasse der a/ß-Hydrolasen aufgeklärt. Der erste Teil des vorliegenden Antrags befasst sich mit strukturellen und funktionellen Experimenten zur Ermittelung des molekularen Mechanismus der HNL aus Mandel (Prunus amygdalus), dessen native 3D-Struktur kürzlich im Labor des Antragstellers bestimmt wurde. Der Antrag beinhaltet die kristallographische Strukturbestimmung von Mutanten, von Enzymvarianten mit einem reduzieren Cofaktor sowie von Enzym- Substratkomplexen. Die strukturellen Untersuchungen sollen durch funktionelle Studien ergänzt werden. Neben ihrem inhärenten wissenschaftlichen Interesse werden die mechanistischen Ergebnisse als Basis zum Design von Enzymen mit verbesserten Eigenschaften für die industrielle Biokatalyse herangezogen werden. Weiters ist die kristallographische Bestimmung der 3D-Struktur der HNL aus Flachs (Linum Usitatissimum) Teil des Antrags. Diese HNL ist mit zinkabhängigen Alkoholdehydrogenasen verwandt und bildet einen neuen und bis jetzt strukturell nicht charakterisierten Typ von HNL. Die Bestimmung der nativen 3D-Struktur wird Ausgangspunkt für strukturelle und funktionelle Studien an Mutanten und and Komplexen mit dem Ziel der Aufklärung des molekularen Mechanismus bilden.

Hydroxynitrillyasen (HNLs) katalysieren die Cyanhydrinreaktion, d.h. die reversible Spaltung von a-Cyanhydrinen zu Blausäure und dem entsprechenden Aldehyd oder Keton. In ihrer biologischen Funktion sind sie Teil eines pflanzlichen Abwehrsystems, welches auf der Toxizität der Blausäure beruht. HNLs zeigen eine große natürliche Diversität, d.h. mehrere verschiedene HNLs sind entstanden durch konvergente Evolution aus Vorgängermolekülen, die zu völlig verschiednen Protein-Superfamilien gehören. Die sehr unterschiedlichen Architekturen der aktiven Stellen in diesen nicht verwandten Enzymen liefert Einblicke in die strukturellen Voraussetzungen für die Katalyse der Cyanhydrinspaltung. HNLs werden zur Zeit als industrielle Biokatalysatoren für die enantioselektive Synthese chiraler Cyanhydrine in einem Umfang von mehreren 100 Jahrestonnen verwendet. Als Folge der großen natürlichen Vielfalt der Hydroxynitrillyasen sind Enzyme sowohl mit (R) als auch mit (S) Enantioselektivität verfügbar. 3D-Strukturdaten (zu einem beträchtlichen Teil aus dem Labor des Antragstellers) sind zur Zeit verfügbar für drei Typen von HNL: solchen, die mit a/ß-Hydrolasen, mit FAD- abhängigen Oxireduktasen und mit Carboxipeptidasen verwandt sind. Ein detaillierter molekularer Mechanismus wurde bislang aber nur für HNLs aus der Klasse der a/ß-Hydrolasen aufgeklärt. Der erste Teil des vorliegenden Antrags befasst sich mit strukturellen und funktionellen Experimenten zur Ermittelung des molekularen Mechanismus der HNL aus Mandel (Prunus amygdalus), dessen native 3D-Struktur kürzlich im Labor des Antragstellers bestimmt wurde. Der Antrag beinhaltet die kristallographische Strukturbestimmung von Mutanten, von Enzymvarianten mit einem reduzieren Cofaktor sowie von Enzym- Substratkomplexen. Die strukturellen Untersuchungen sollen durch funktionelle Studien ergänzt werden. Neben ihrem inhärenten wissenschaftlichen Interesse werden die mechanistischen Ergebnisse als Basis zum Design von Enzymen mit verbesserten Eigenschaften für die industrielle Biokatalyse herangezogen werden. Weiters ist die kristallographische Bestimmung der 3D-Struktur der HNL aus Flachs (Linum Usitatissimum) Teil des Antrags. Diese HNL ist mit zinkabhängigen Alkoholdehydrogenasen verwandt und bildet einen neuen und bis jetzt strukturell nicht charakterisierten Typ von HNL. Die Bestimmung der nativen 3D-Struktur wird Ausgangspunkt für strukturelle und funktionelle Studien an Mutanten und and Komplexen mit dem Ziel der Aufklärung des molekularen Mechanismus bilden.