Genexpressionsmuster nach Hypericin-PDT

Die Photodynamische Tumortherapie (PDT) ist ein sehr vielversprechender neuer Ansatz der Tumorbehandlung. Sie beruht auf der bevorzugten Aufnahme und Speicherung eines Photosensibilisators durch Tumore und der Produktion reaktiver Sauerstoffarten während der Bestrahlung des im Tumorbereich angereicherten Photosensibilisators mit sichtbarem Licht. Die PDT zeichnet sich sowohl durch hohe Tumorspezifität, als auch durch geringe Nebenwirkungen im Gegensatz zu Strahlen- oder Chemotherapie aus. Der Extrakt Hypericin der Pflanze Hypericum perforatum, bekannt als Johanniskraut, wurde erst vor kurzem als sehr wirksamer Photosensibilisator entdeckt; er wird erfolgreich in der Tumordiagnose angewandt und derzeit für die klinische Behandlung getestet. Bis jetzt konnte noch nicht nachgewiesen werden, ob niedrige Dosen von Hypericin auch in Tumoren in dem hohen Ausmaß Apoptose auslösen können wie in-vitro; die Art des Zelltodes ist aber entscheidend für eine immunologische anti-Tumor-Antwort nach PDT. Ein tieferer Einblick in die Schritte der Signalübertragungswege nach PDT fehlt jedoch. Ist die Herkunft dieser intrazellulären Signale, die Integration und die Interpretation durch die Zelle einmal bekannt, wird man auch mehr über diejenigen Proteine erfahren, die in die Regulation und Ausführung der Zelltodprogramme und in die Modulation immunologischer anti-Tumor-Mechanismen involviert sind. Das Ziel des Projektes ist es daher, die grundlegenden Prozesse einer erfolgreichen Hypericin-PDT durch eine umfangreiche Expressionsanalyse nach Behandlung der Plattenepithelkarzinom-Zelllinie A-431 als menschliches Tumorzellmodell zu erforschen. Differentiell exprimierte Gene sollen mittels high density cDNA-Arrays mit etwa 10 000 ESTs detektiert und mittels Real-Time-PCR verifiziert werden. Die Kenntnis des Expressionsmusters von Tumorzellen nach PDT mit Hypericin kann zu neuen Ansätzen in der Steigerung der PDT-Effekte dieses vielversprechenden Photosensibilisators führen. Zusätzlich sollen die Genexpressionsmuster von Hypericin- und ALA-behandelten A-431-Zellen (aus dem Vorprojekt) miteinander verglichen werden. Die unterschiedliche Entwicklung des photodynamischen Schadens zum apoptotischen und/oder nekrotischen Zelltod sollen analysiert und diskutiert werden.

Die Photodynamische Tumor-Therapie (PDT) ist eine relativ neue Möglichkeit zur Behandlung von malignen und auch nicht-malignen Erkrankungen sowie auch von bakteriellen und viralen Infektionen. Sie basiert auf einer bevorzugten Aufnahme eines an sich harmlosen Farbstoffes, einem so genannten Photosensibilisator, in Zielzellen und einer Produktion von Sauerstoffradikalen während der Bestrahlung des angereicherten Sensibilisators durch Licht einer geeigneten Wellenlänge. Dies führt zur Zerstörung der Zielzellen durch Apoptose und/oder Nekrose. Hypericin, ein Bestandteil des Johanniskrautes (Hypericum perforatum), gewinnt derzeit rasch an Bedeutung als Photosensibilisator, sowohl für die therapeutische Anwendung, da es auch bei sehr niedriger Dosierung sehr effektiv ist, als auch als Fluoreszenzmarker in der Diagnose wegen seiner starken Fluoreszenz und einer sehr hohen Selektivität. Das Ziel des vorliegenden Projektes war die grundlegenden molekularbiologischen Antwortmechanismen auf photodynamischen Behandlung mit Hypericin (HYP-PDT) des Modellsystems A-431 Zellen mittels eines detaillierten und umfassenden Ansatzes aufzuklären. Um diese Anforderungen zu erfüllen, wurden Genexpressionsmuster von HYP-PDT behandelten Proben, die nach 1.5, 3, 5 und 8 Stunden nach Behandlung genommen wurden, mit Hilfe von high-density cDNA-Arrays mit 9738 EST-Sequenzen erstellt. Gene, die Expressionsänderungen größer 2 zeigten, wurden auf Grund der Funktion ihrer Genprodukte zu Klassen zusammengefasst. Diese funktionellen Gruppen waren (Anzahl der hoch-regulierten Genen / Anzahl der nieder- regulierten Gene): Apoptose (55/2), oxidativer Stress (25/4), Cytoskelett und Zellanhaftung (24/12), Proliferation and Zellzyklus (17/9), MAPK Signalweg (17/5), Protein Transport (10/2), Energstoffwechsel (8/7), G-Protein Signalweg (6/2), RNA Prozessierung (6/2). Mittels real-time PCR konnten von 46 untersuchten Gene 25, die hoch-reguliert wurden, und 8 Gene, die nieder- reguliert wurden, verifiziert werden. Die stärkste Niederregulierung (5.8 fach) zeigte Thrombospondin 1, welches in Angiogenese, Zellanheftung und Apoptose involviert ist. Alle anderen nieder-regulierten Gene zeigten nur eine schwache Änderung (2-3fach) und sind in die Zellanheftung involviert. Die stärkste Hochregulierung (>100fach) zeigten die frühen Stress-Antwort-Gene CL-100, c-Fos, c-Jun and Not. Die Analyse der Genexpression nach HYP-PDT an A-431 Zellen zeigte Änderungen in mehreren zellulären Übertragungswegen (oxidativer Stress, MAPK, Stress des endoplasmatischen Retikulums) sowie auch der Zellanhaftung. Diese Ergebnisse weichen von denen unseres vorangegangenen FWF-Projektes (P15143), in dem die Genexpression nach ALA-PDT untersucht wurde, ab. Der Grund dafür liegt in der unterschiedlichen Lokalisierung der Sensibilisatoren und in der damit verbundenen anderen Art des Zelltodes.