Reaktionsmechanismen und strukturelle Dynamik des Ribosoms

Das Ribosom, ein essentielles und multifunktionelles Partikel, ist für die Proteinsynthese in allen Zellen zuständig. Das Ribosom ist aus zwei Untereinheiten aufgebaut, die wiederum aus ribosomaler RNA (rRNA) und ribosomalen Proteinen zusammengesetzt sind. Ergebnisse jahrelanger biochemischer und neuester kristallographischer Studien zeigten, daß alle ribosomalen Funktionen von den rRNAs bewerkstelligt werden. Trotz detailierter Einsicht in die Struktur des Ribosoms, sind die Mechanismen der beiden Hauptreaktionen der großen ribosomalen Untereinheit (Peptidbindung und Peptid release) auf der molekularen Ebene noch nicht aufgeklärt. Ziel dieses Forchungsprojektes ist es, modifizierte RNA Nukleotide stellenspezifisch in das aktive Zentrum der großen Untereinheit einzubauen, um damit die molekularen Mechanismen der fundamentalen ribosomalen Reaktionen aufzuklären. Da das Ribosom der Hauptangriffspunkt vieler klinisch relevanter Antibiotika ist, ist dessen funktionelles Verständnis von potentieller Bedeutung für die Bekämpfung von Antibiotika Resistenzen und für die Erzeugung neuer anti-mikrobieller Substanzen. Aufgrund der Komplexität des Ribosoms und der größe der rRNAs war der stellen-spezifische Einbau eines einzelnen modifizierten Nukleotids in die ribosomale RNA nicht möglich. Mit der Entwicklung einer neuen Strategie für die in vitro Rekonstitution der großen ribosomalen Untereinheit, kann dieses Problem gelöst werden. Die Idee ist es, eine ribosomale RNA zu konstruieren, deren natürliche Enden kovalent Verbunden sind, wobei neue Endpunkte anderswo im Molekül eingeführt werden (zirkulär permutierte rRNA). Die neuen Enden werden so ausgewählt, daß sie nahe dem aktiven Zentrum sind und werden zum stellen-spezifischen Einbau eines modifizierten Nukleotids innerhalb des Ribosoms verwendet werden. Diese modifizierte RNA wird anschließend zusammen mit den ribosomalen Proteinen zu großen ribosomalen Untereinheiten rekonstituiert. Damit können die funktionellen Auswirkungen dieser Nukleotid Modifikation auf die Peptidbindung und den Peptid release untersucht werden. Zusätzlich kann diese Technik auch zur Aufklärung der ribosomalen Dynamik herangezogen werden. In diesem Fall wird ein photo-reaktives Nukleotid am neu eingeführten Ende der zirkulär permutierten rRNA eingebaut. Photo-crosslink Untersuchungen an Ribosomen in unterschiedlichen funktionellen Stadien können Aufklärung über strukturelle Änderungen des Ribosoms während der Proteinsynthese bringen.

Im Rahmen dieses Forschungsprojektes haben wir eine neue experimentelle Methode (die gapped-cp- reconstitution`) entwickelt und angewendet, die es uns erlaubte, stellen-spezifisch nicht-natürliche RNA Bausteine in das kaltalytische Herz des Ribosoms einzubauen. Biochemische und neueste kristallographische Daten zeigten, dass das katalytische Zentrum der grossen ribosomalen Untereinheit (das Peptidyltransferase Zentrum) ausschliesslich aus 23S ribosomaler RNA aufgebaut ist. Das bedeutet, dass die beiden Hautreaktionen der Protein Biosynthese, die Peptid-Bindung und die Peptid- Freisetzung, durch einen rRNA katalysierten Mechanismus bewerkstelligt werden. Da Ribosomen von so fundamentaler Wichtigkeit für das Leben sind und auch den Hauptangriffspunkt für die meisten klinisch relevanten Antibiotika darstellen, ist das molekulare Verständnis der Ribosomen von entscheidender molekularbiologischer Bedeutung. Vorangegangene Mutationsstudien an allen potentiell katalytischen Nukleotiden des Peptidyltransferase Zentrums konnten den katalytischen Mechanismus der Peptid-Bindung nicht restlos aufklären. Offensichtlich ist das chemische Repertoir das durch den Einbau natürlicher Basenmutanten erzielt werden kann, nicht ausrechend, um die Peptid-Bindung auf dem molekularen Ebene zu verstehen. Der neue experimentelle Ansatz erlaubte es uns nun jedoch, gezielt einzelne chemische Gruppen und sogar einzelne Atome zu verändern. Diese Vorgangsweise vergrössert signifikant den Pool an chemisch unterschiedlichen Gruppen, die spezifisch in das Ribosom, ein Enzym mit ca 1.8 MD Grösse, eingebracht werden können. Mithilfe der gapped-cp-reconstitution` modifizierten wir zwölf universell konservierte Nukleotide im katalytischern Zetrum. Es stellte sich heraus, dass eine einzige chemische Gruppe, das 2`-Hydroxyl des Ribose Zuckers an der Position A2451 der 23S rRNAS, entscheidend für die Peptid- Bindung ist. Im Gegensatz zu vorangegangenen Theorien, zeigte die Modifikation der Adenin Base an diesem RNA Baustein keine wesentliche Auswirkung auf die Reaktion, zumindst unter den von uns angewendeten in vitro Bedingungen. Diese Daten erklären auch, warum die Wichtigkeit dieses 2`-Hydroxyls durch die vorangegangenen Standard Mutationsstudien nicht identifiziert werden konnte, da keine der natürlichen Mutanten diese Gruppe verändern konnten. Diese Erkenntnisse unterstreichen auch das Potenzial unserer neuen Methode für weitere funktionelle Studien am Ribosom. Wir haben daher weiters die experimetellen Bedingungen optimiert, um diese neue Methode auch zur Unteruchung der Peptid-Freisetzung während der Terminatonsphase der Proteinbiosynthese sowie der tRNA Translokation während der Elongationsphase anwenden zu können.