Diagnostik und Management invasiver Pilzinfektionen

Invasive Pilzinfektionen (IPI) gehen bei immungeschwächten Patienten unter intensiver Chemotherapie im Rahmen maligner Erkrankungen oder vor einer Knochenmarktransplantation (KMT) mit einer hohen Morbidität und Mortalität einher. Die Inzidenz von IPI bei febrilen Patienten mit therapieinduzierter Neutropenie wird auf 10-20% geschätzt und die Mortalitätsrate beträgt in solchen Fällen bis zu 80%. Der` Großteil invasiver Pilzinfektionen wird durch verschiedene Candida und Aspergillus Stämme verursacht. Allerdings zeigen neue epidemiologische Studien aus Nordamerika ein zunehmendes Auftreten von bisher selten beobachteten Pilzarten, wie etwa hyalinen Schimmelpilzen, chromogenen Fadenpilzen, und Hefeähnlichen Pathogenen. Von Europäischen Zentren gibt es nur vereinzelt Berichte über das Vorkommen dieser Pilzarten. Dies könnte entweder auf ein weniger häufiges Vorkommen oder auf unzureichende Diagnose dieser Pathogene zurückzuführen sein. Die derzeitige Diagnostik einer IPI beruht auf mikrobiologischen, histopathologischen, und radiologischen Untersuchungen. Diese Verfahren sind allerdings oftmals nicht sensitiv oder schnell genug, um eine rationale und zeitgerechte Behandlung zu ermöglichen In den meisten klinischen Situationen beruht daher der Einsatz antimykotischer Therapie nur auf indirekten Hinweisen auf das Vorliegen einer systemischen Pilzinfektion, zumeist klinischen Zeichen einer Sepsis, die mehr als 72-96 Stunden auf diverse antibakterielle Therapiemaßnahmen nicht anspricht. Diese Vorgangsweise kann aber bei Vorliegen einer Pilzsepsis zu einer eventuell folgenschweren Verzögerung des Einsatzes antimykotischer Therapie führen Andererseits spricht jedoch die ausgeprägte Organtoxizität mancher antimykotischen Substanzen gegen deren prophylaktische Verabreichung. Der Einsatz systemischer Pilztherapie, der nur auf der Grundlage eines klinischen Verdachts beruht, führt in Fallen, in denen keine IPI vorliegt, zu einer unnötigen Erhöhung der Organtoxizität. Es wäre daher bei immunsupprimierten Patienten von großer Wichtigkeit, ein Management der antimykotischen Therapie zu erarbeiten, das auf verlässlichen diagnostischen Daten beruht. Um dieses Ziel zu erreichen, müssen Verfahren für einen schnellen Nachweis invasiver Pilzinfektionen entwickelt werden. Diese würden einen frühzeitigen Therapiebeginn ermöglichen der eine wesentliche Voraussetzung für den Behandlungserfolg darstellt. Um die Fragestellungen der vorliegenden Studie bearbeiten zu können ist die Etablierung eines quantitativen DNA- Detektionsverfahrens für pathogene Pilze unter Verwendung der real-time Q-PCR Technologie geplant. Die Konzeption dieses ,,Pan-Fungus" Tests sollte den Nachweis und die Quantifizierung aller klinisch relevanten Pilz-Species in einer Reaktion ermöglichen Das Spektrum der humanpathogenen Plize, die von diesem Assay abgedeckt werden sollen, beinhaltet alle wichtigen Aspergillus- und Candida-Stämme sowie andere Hefe- und Schimmelpilze von möglicher klinischer Relevanz. Zu diesen gehören unter anderem Trichosporon-, Fusarium-, Mucor- und Rhizopus-Stämme sowie Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae und Malassezia furfur. Das konzeptuelle Design des geplanten Pan-Fungus RQ-PCR Verfahrens sollte den Nachweis von etwa 20 pathogenen Pilzen in einem Test ermöglichen Die breite Spezifität des Assays würde über die Kapazität der derzeit verfügbaren real-time PCR Methoden deutlich hinausgehen. Nach Etablierung der erforderlichen diagnostischen Verfahren, wird eine multizentrische Studie bei pädiatrischena Patienten unter intensiver Chemotherapie von malignen hämatologischen Erkrankungen, ausgewählten soliden Tumoren sowie nach allogener KMT durchgeführt. Im Rahmen der Studie werden folgende Hypothesen geprüft: 1. Bei einem Teil der pädiatrischena Patienten kommt es während der frühen Phase der Chemotherapie zu einer asymptomatischen Fungamie, die mit Hilfe des Screenings mittels Pan-Fungus-PCR detektierbar ist. Diese Patienten haben ein besonders hohes Risiko, in Phasen der Aplasie an einer IPI zu erkranken. 2. Molekularer Nachweis und Quantifizierung pathogener Pilze im peripheren Blut ermöglichen bei Patienten mit febriler Neutropenie die frühzeitige Diagnose einer invasiven Pilzinfektion. 3. Negative molekulare Befunde für Pilzpathogene im peripheren Blut stellen ein Ausschlusskriterium für das Vorliegen einer IPI dar. Die Studie wird zeigen, ob ein Pilzpathogen-Screening mit molekularen Methoden bei Kindern unter Chemotherapie die Früherkennung von jenen Patienten ermöglicht die ein hohes Risiko für eine IPI haben und die daher von einer präemptiven Pilztherapie profitieren würden Darüber hinaus erwarten wir, dass die Ergebnisse dieser Studie Grundlagen für eine rationale Therapie invasiver Pilzinfektionen liefern werden. Die quantitative RQ- PCR Diagnostik soll einerseits eine frühzeitige Behandlung von Patienten mit einer IPI ermöglichen und andererseits, in Fällen, in denen keine systemische Pilztherapie indiziert ist, eine zusätzliche therapiebedingte Toxizität verhindern.

Der wesentliche Erfolg des abgeschlossenen Projektes liegt in der Entwicklung und Patentierung (A 1934/2005) verschiedener molekularer Verfahren auf der Grundlage der real-time PCR, die einen hochsensitiven und quantitativen Nachweis eines breiten Spektrums humanpathogener Pilze ermöglichen. Der Pan-AC RQ-PCR Assay gestattet die Detektion und Quantifizierung aller klinisch relevanten Aspergillus und Candida Arten (Spezies), die derzeit für den Großteil der invasiven Pilzinfektionen bei Menschen verantwortlich sind. Der zweite wichtige, von uns entwickelte Test, der Pan-fungus RQ-PCR Assay, gestattet einen schnellen und ökonomischen Nachweis von mehr als 80 verschiedenen Pilzspezies und hat damit die bei weitem breiteste Spezifität aller bisher verfügbaren, molekularen Pilzdetektionsverfahren. Dieser Assay deckt nicht nur alle klinisch interessanten Aspergillus und Candida Spezies ab, sondern detektiert auch praktisch alle neu auftretenden Pilzarten, die mit zunehmender Häufigkeit bei Patienten mit geschwächter Immunabwehr beobachtet werden. Die neuen Pilzdetektionsverfahren wurden zur Analyse von prospektiv gesammelten Blutproben eingesetzt, die primär von Patienten stammten, die in unserem Krankenhaus mit einer allogenen Stammzelltransplantation behandelt wurden. Mehr als 5.000 Analysen wurden in seriellen Patientenproben durchgeführt, wobei eine Reihe verschiedener, zum Teil seltener Pilzarten beobachtet wurde. Die Inzidenz von molekular nachgewiesenen, invasiven Pilzinfektionen lag in der untersuchten Patientenpopulation bei 20%. Die Identifizierung einzelner Pilzspezies mit Hilfe der PCR-Fragmentlängenanalyse, einem im Rahmen dieses Projektes etablierten Verfahren, wurde zunächst mittels DNA-Sequenzierung bestätigt, um die Verlässlichkeit dieser Methodik zu überprüfen. In der Schlussphase des Projektes haben wir mit der Entwicklung einer alternativen Methode zur raschen Identifizierung von Pilzspezies begonnen, die auf einer Microbead-Hybridisierung mit durchflusszytometrischer Detektion beruht. Dieses viel versprechende und möglicherweise patentierbare Verfahren, das sich derzeit in einem fortgeschrittenen Stadium der Entwicklung befindet, wäre vor allem dank seiner hohen Spezifität ein wichtiger Fortschritt in der klinischen Pilzdiagnostik. Die aus diesem Projekt resultierenden, wichtigen Beobachtungen haben uns die extrem hohe Kontaminationsgefahr der molekularen Pilzassays vor Augen geführt, die auf das ubiquitäre Vorkommen von Pilzsporen und Spuren von Pilz-DNA zurückzuführen ist. Um mit den Analysen klinischer Proben auf einem hohen Sicherheitsniveau fortfahren zu können, ist ein Ausbau des Labors und eine zusätzliche Biohazard-Austattung erforderlich. Im Rahmen von rezent initiierten Nachfolgeprojekten, die auf den wichtigen Erkenntnissen aus dem abgeschlossenen FWF-Projekt aufbauen, sollen die neuen Detektionsverfahren in Kooperation mit einem Industriepartner bis zur Marktreife weiter entwickelt werden. Wir sind überzeugt, dass die im Rahmen dieser vom FWF geförderten Studie gewonnenen Erkenntnisse einen wichtigen Beitrag zur Optimierung der klinischen Pilzdiagnostik bei immunsupprimierten Patienten und damit zu einer Verbesserung des Therapieerfolges leisten werden.