Mycoplasma agalactiae DNA Rekombinase und Antigenvariation

Mycoplasma agalactiae ist der Erreger der "Infektiösen Agalaktie" bei Schafen und Ziegen, ein Krankheitssyndrom, das sich primär in chronischer Mastitis, Arthritis und Konjunktivitis manifestiert. Trotz seines kleinen Genoms besitzt dieser bakterielle Krankheitserreger ein raffiniertes genetisches System, welches ihm erlaubt, sein Antigenrepertoire mit einer ungewöhnlich hohen Frequenz zu verändern. Dieses vpma System besteht aus sechs voneinander unterscheidbaren aber verwandten Genen, die als Einzelkopien vorliegen und die wichtigsten immunodominanten Oberflächenproteine kodieren, welche infolge von ortsspezifischen DNA-Rearrangements in ihrer Expression variieren. Diese Rekombinationsereignisse finden innerhalb klonaler Populationen statt und werden vermutlich durch die Aktivität einer ortsspezifischen Rekombinase gesteuert, die von dem xer1 Gen kodiert wird, welches sich in der Nähe des vpma-Lokus befindet. Analoge, aber distinkte Genfamilien wurden auch in anderen Mykoplasmenspezies gefunden, und es wird angenommen, dass sie den Mykoplasmen zur Umgehung der Immunantwort und zur Kolonisierung des Wirtes dienen. Die gemeinsamen Eigenschaften der Mitglieder einer bestimmten Genfamilie und die hohe Variabilität ihrer Expression hat detailliertere Studien über die Rolle dieser Proteine während des Krankheitsverlaufs bisher erschwert. Dies liegt auch daran, dass es schwierig ist, Mykoplasmen genetisch zu manipulieren, um diese Gene durch Einbau von Mutationen zu modifizieren. Vor kurzem gelang es erstmalig, Fremd-DNA in das M. agalactiae-Genom einzubringen, wodurch eine Grundlage für die Entwicklung von Methoden zum gezielten "knock-out" von Genen geschaffen wurde. In diesem Projekt werden diese Methoden weiterentwickelt und optimiert, um verschiedene experimentelle Folgestudien zu ermöglichen, die zur Klärung der Rolle der Vpmas im Zuge einer Infektion mit M. agalactiae beitragen können. Durch Inaktivieren des xer1-Gens werden Mutanten generiert, die in einem bestimmten Vpma-Expressionsmuster arretiert werden. Des weiteren wird die Art der Regulation und die Wirkungsweise der Xer1- Rekombinase als mögliches Schlüsselelement der Oberflächenantigenvariation und der Patho-genität von M. agalactiae untersucht. Insgesamt lässt dieses Projekt Ergebnisse erwarten, die festlegen, ob die Xer1-Rekombinase allein oder in Interaktion mit anderen Faktoren DNA-Rearrangements hervorzuruft, und wie der vpma-Genlokus im Detail kontrolliert wird. Darüber hinaus bieten sich die Xer1-negativen Mutanten mit einem in einer bestimmten "Phase" fixierten Vpma- Expressionsmuster für die Anwendung in in vitro- als auch in in vivo-Modellen an, um die Rolle der vpma- Genfamilie und des xer1-Gens in der Pathogen-Wirt-Beziehung zu klären. Schliesslich wird durch die hier etablierten Daten und Methoden eine hervorragende Basis geschaffen, die es erlauben wird, M. agalactiae- Virulenzgene durch Insertionen zu mutieren.

Im Vergleich zu anderen pathogenen Bakterien ist das derzeitige Grundlagenwissen über die molekulare Basis der Pathogenität von Mykoplasmen nur begrenzt, so dass ihre Infektionsstrategien auf zellulärer und molekularer Ebene noch weitgehend unverstanden sind. Zahlreiche Studien an verschiedenen pathogenen Mykoplasmen haben inzwischen gezeigt, dass sie ausgeklügelte genetische Systeme besitzen, wodurch sie befähigt sind, ihre antigene Zelloberflächenstruktur ungewöhnlich häufig zu verändern. Es wird angenommen, dass diese variablen Oberflächenantigene den zellwandlosen Mykoplasmen zur Umgehung der Immunantwort und zur Kolonisierung des Wirtes dienen. Im Zuge solcher Untersuchungen an Mycoplasma agalactiae, dem Erreger der "Infektiösen Agalaktie" der Schafe und Ziegen, konnte ein einer Pathogenitätsinsel ähnlicher Genlokus identifiziert werden, der sechs unterscheidbare aber verwandte Gene beinhaltet, welche die wichtigsten immunodominanten Oberflächenmembranproteine, die sogenannten Vpmas, kodieren, deren Expression infolge von DNA- Umlagerungen mit ungewöhnlich hoher Frequenz variiert. Diese DNA-Umlagerungen werden vermutlich durch eine ortsspezifische Xer1 Rekombinase gesteuert. Der Mangel an Möglichkeiten, M. agalactiae genetisch zu manipulieren, hat Studien über die präzise Rolle der Vpmas im Infektionsprozess bisher erschwert. Vor kurzem gelang es erstmalig, Fremd-DNA in das M. agalactiae Genom einzubringen, wodurch eine Grundlage für die Entwicklung von Methoden zum gezielten "knock-out" von Genen geschaffen wurde. Um die Bedeutung der Vpma Proteine in vivo zu ermitteln, war das Ziel dieses Projekts, Mutanten von M. agalactiae herzustellen, die nicht mehr in der Lage sind die Expression ihrer Vpma Proteine zu variieren. Dabei wurde davon ausgegangen, dass mittels einer gezielten Ausschaltung des xer1-Gens M. agalactiae-Mutanten hergestellt werden könnten, welche in ihrer Vpma-Expression arretiert sind. In diesem Projekt konnten wir die Transformationsverfahren für M. agalactiae optimieren, so dass DNA effizient in das M. aglactiae Genom eingebracht werden konnte. Durch Verwendung sogenannter oriC Plasmide konnte weiters das Hauptziel dieses Projekts erreicht werden, die gezielte Inaktivierung des xer1 Gens mittels homologer Rekombination. Die in ihrer Vpma-Expression arretierten M. agalactiae-Mutanten können nur mehr eine bestimmte Vpma-Variante an ihrer Oberfläche präsentieren und sind nicht mehr befähigt, zu einem anderen Vpma-Phänotyp zu wechseln. Die Herstellung solcher in ihrer Phase arretierten Mutanten stellt einen Durchbruch in der Erforschung der molekularen Pathogenese von M. agalactiae dar, da diese nun zukünftig in experimentellen Infektionsstudien verwendet werden können, um die exakte Rolle der Vpma-Oszillation unter in vivo-Bedingungen im natürlichen Wirt zu definieren.