Wird die DNS von Cohesin umringt?

Die Herstellung und Beibehaltung der Kohesion zwischen Schwesterchromatiden sind eine notwendige Voraussetzung für korrekte mitotische Chromosomensegregation. Neu replizierte DNS-Moleküle werden durch einen aus mehreren Untereinheiten bestehenden Proteinkomplex zusammengehalten, den Cohesin-Komplex. Cohesin ist aufgebaut aus zwei Smc-Untereinheiten, Smc1 und Smc3, der Scc1-Untereinheit (genannt "Kleisin") und zwei weiteren Untereinheiten, Scc3 und Pds5. Biochemische und elektronenmikroskopische Studien implementieren, daß Cohesin die Struktur eines Ringes besitzt. Smc1 und Smc3 falten sich zu elongierten Molekülen mit langen "coiled-coil"-Regionen, deren eine Seite durch eine "Gelenk"- und deren andere Seite durch eine "Kopf"-Region flankiert wird. Das Gelenk dient als Dimerisierungsdomäne, welche die Smc1- und Smc3- Protamere zusammenhält. Die Smc1- und Smc3-Köpfe werden durch die "Kleisin"-Untereinheit Scc1 verbrückt. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist Cohesin von später G1 bis zum Beginn der Anaphase mit Chromosomen assoziiert. Beim Übergang von der Meta- zur Anaphase wird Scc1 von einer spezifischen Protease geschnitten, der Separase. Nachdem es geschnitten wurde, dissoziiert Cohesin von den Chromosomen, wobei aber die proteolytischen Spaltprodukte von Scc1 über ihre Assoziierung mit dem Smc1/Smc3-Heterodimer weiterhin miteinander verbunden bleiben. Eine zentrale, immer noch unbeantwortet gebliebene Frage ist die räumliche Anordnung der DNS im Bezug auf Cohesin. Gemäß dem "Ringmodell" würden Schwester-DNS-Moleküle durch den Cohesin-Ring verlaufen und wären somit in ihm "gefangen". Unser Projekt wird dies experimentell testen. Hierfür werden wir zirkuläre DNS (Plasmid) assoziiert mit Cohesin direkt von Hefezellen aufreinigen. Wir werden diese DNS mit Restriktionsendonukleasen verdauen und testen, ob ihre Assoziierung mit Cohesin durch ihre Linearisierung beeinflußt wird. Das "Ringmodell" sagt hierfür voraus, daß Cohesin auf geschlossener zirkulärer DNS festgehalten wird, während es vom linearisierten Molekül hinunterrutscht. Des weiteren werden wir den Cohesin-Ring entweder über seine Scc1-Untereinheit oder in der Coiled-coil-Region von Smc3 schneiden und überprüfen, ob dies ebenso eine Dissoziierung des Cohesins von der DNS bewirkt. Schließlich werden wir das Linearisierungsexperiment in vivo versuchen, indem wir Cohesin-reiche Chromosomenbereiche entweder als kovalent geschlossene Ringe über eine sequenzspezifische Rekombinase oder als lineare Fragmente über Phage-N15-Telomerresolvase herauslösen werden. Die Assoziierung von Cohesin mit diesen Fragmenten wird über Chromatinimmunopräzipitation (CHIP) getestet werden. Zuletzt planen wir Scanning-Force-Mikroskopie-Untersuchungen (SFM) an den aufgereinigten Cohesin-DNS-Komplexen.