NMR Analyse der Virus - Rezeptor Interaktion

Rhinoviren des Menschen (HRVs) sind die Haupterreger von Schnupfen. Als Picornaviridae bestehen sie aus vier viralen Kapsidproteinen, die ein RNA Genom positiver (messenger) Polarität in Form eines icosahedrischen Kapsids umschließen. Trotz ihrer evolutionär nahen Verwandtschaft weisen die 102 verschiedenen Serotypen im Hinblick auf den zum Zelleintritt verwendeten Rezeptor verschiedene Spezifität auf: Die kleine Gruppe, mit 10 Serotypen, bindet an den low-density Lipoprotein-receptor und die große Gruppe, mit 91 Serotypen, bindet an das intercellular adhesion molecule 1. Der Hintergrund dieser Rezeptorspezifität, sowie das Prinzip, dem die Erkennung eines bestimmten Rezeptors durch eine Reihe von Serotypen zugrunde liegt, ist unbekannt. In allen minor group HRVs ist nur ein einziges an der Oberfläche exponiertes Lysin in der HI Schleife von VP1 konserviert, das in den meisten major group HRVs nicht vorhanden ist. Dieses Lysin scheint notwendig aber nicht ausreichend für die Rezeptorbindung zu sein. Andererseits enthält LDLR negativ geladene Aminosäurereste, die höchstwahrscheinlich Salzbrücken mit der positiv geladenen Virusoberfläche herstellen. Um die Interaktion zwischen Virus und Rezeptor im molekularen Detail zu verstehen ist die Kenntnis der komplementären Oberflächen, der Prinzipien der wechselseitigen Erkennung und Unterscheidung und der molekularen Dynamik des Bindungsprozesses notwendig. Vor kurzem entwickelte NMR Methoden erlauben die Charakterisierung von Ligandenbindungen (z.B. die Bindung von (kleinen) Rezeptoren an (grosse) Viren) mit atomarer Auflösung. Diese Methoden sind besonders gut für das Studium der Interaktion eines einzelnen Ligandenbindung-repeats des Rezeptors (~ 4 x103 D) mit verschiedenen minor group Viren (~ 8 x106 D) geeignet. Als Hauptresultat dieser Untersuchungen erwarten wir i) die Identifizierung jener Aminosäurereste des Rezeptors, die den Hauptbeitrag zur Viruserkennung leisten, ii) ein umfassendes Verständnis der molekularen Basis der Virus-Rezeptor Erkennung und Unterscheidung, und iii) die Bestimmung der Bindungskinetik. Die Strategien, die während dieser Arbeiten etabliert werden sollen und die daraus erwachsenden Erkenntnisse werden auf andere Virus-Rezeptor Systeme anwendbar sein und zu einer einfachen Methode zur Charakterisierung interagierender molekulare Oberflächen führen.

Rhinoviren des Menschen verursachen Schnupfen, eine Infektion, die normalerweise auf den oberen respiratorischen Trakt beschränkt bleibt und zu massiver Absonderung von Schleim führt. Aufgrund der großen Anzahl unterschiedlicher Serotypen wird praktisch jeder Mensch während des gesamten Lebens mehrmals im Jahr infiziert da Immunität gegenüber einem Virusstamm nicht gegen eine Infektion mit einem anderen Virusstamm schützt. Siebenundachtzig (major receptor group) der 99 Rhinovirus Serotypen verwenden das interzelluläre Adhäsionsmolekül 1 um in die Zelle zu gelangen, wohingegen 12 Serotypen (minor receptor group) unter Verwendung von Vertretern der low-density Lipoprotein - Rezeptorfamilie infiziert. Durch die vor Kurzem durchgeführte Röntgenstrukturanalyse eines Komplexes zwischen einem Virus der minor receptor group (HRV2) und einem Fragment des very-low density Lipoprotein - Rezeptors gelang die Identifikation der Aminosäurereste, die an der Interaktion beteiligt sind; abgesehen von einem einzigen Lysin, das in allen Viren der minor group in einer Oberflächen - exponierten Schlinge des Kapsidproteins VP1 vorhanden ist, ist keiner der anderen Reste strikt konserviert. Die Grundlage für die hochspezifische Rezeptorerkennung ist daher unbekannt. Wir haben deshalb begonnen, die Verwendbarkeit von saturation transfer difference Nuklearmagnetresonanz (STD-NMR) für die Untersuchung der Interaktion von Serotypen der kleinen Gruppe mit ihren Rezeptoren zu untersuchen. Diese Methode erlaubt die Ermittlung der Protonen innerhalb eines kleinen Moleküls, die sich in unmittelbarer Nähe eines großen Moleküls befinden und gibt ein umfassendes Bild der Interaktionsfläche. Bisher wurde diese Methode nur für die Untersuchung der Bindung (kleiner) organischer Verbindungen an (große) Proteine verwendet. Hier wird erstmals ein Rezeptorfragment als Ligand eingesetzt, dessen Größe an die Grenzen der STD NMR Technik stößt. In einer ersten Serie von Experimenten konnten wir zeigen, dass die Kontakte einer organischen antiviral aktiven Verbindung und dem Virus mittels dieser Methode identifiziert werden konnte. Unter Verwendung von Oberflächen Plasmon Resonanz Techniken bestimmten wir die Affinität verschiedener rekombinanter Fragmente des very-low density Lipoprotein Rezeptors zu HRV2 und fanden, dass die kinetischen on- und off Raten eines einzigen Rezeptormoduls innerhalb der notwendigen Grenzen für NMR-Messungen lagen. Pilotexperimente ergaben informative Spektren und zeigten, dass STD-NMR in der Tat für diese Art der Analysen gut geeignet ist. Konstrukte zur Expression von Rezeptormodulen ohne das His6-tag, das eingeführt wurde um die Reinigung zu erleichtern aber die Interpretation der NMR Spektren kompliziert, wurden hergestellt. Zu einer definitiven Zuordnung der Protonen müssen nun 15N and 13C markierte rekombinante Rezeptormodule produziert werden.