Epitope-Tagging von MAP Kinasen in Arabidopsis

Mitogen-activated protein (MAP) Kinasen regulieren eine grosse Vielzahl an Prozessen in Eukaryoten, von abiotischen und biotischen Stressreaktionen bis hin zur Entwicklung. Die komplexe Natur dieser Prozesse ist an der Komplexität der Genfamilien erkennbar, die die Mitglieder der MAP-Kinase-Signaltransduktionskaskaden ausmachen. Wir sind gerade - in einem FWF-geförderten Projekt - dabei, T-DNA-Knock-out-Mutanten verschiedener Mitglieder der Arabidopsis-MAP-Kinase-Genfamilie zu analysieren. Mit 20 Mitgliedern ist die Familie sehr gross, und es ist deshalb ein grosses Problem, die Funktionen der verschiedenen Mitglieder zu unterscheiden. Im beantragten Projektvorschlag zielen wir in erster Linie darauf, das "epitope tagging" von MAP- Kinasen zu verwenden. Mittels eines neuen Ansatzes wird jede T-DNA-Knock-out-Linie mit ihrem eigenen Gen, das durch ein Epitop markiert ist und auch den eigenen Promotor inkludiert, retransformiert. Dieser Ansatz bietet mehrere Vorteile. Die Transkription vom eigenen Promotor aus stellt die korrekte zeitliche und räumliche Expression des Gens sicher und erhält dessen Stöchiometrie. Es gibt keine Konkurrenz zwischen dem endogenen Protein - das durch den Knock-out ausgeschalten wurde - und dem markierten Protein, so dass das markierte Protein für Lokalisierungsstudien, biochemische Tests und Protein-Protein-Interaktions-Untersuchen optimal geeignet ist. Da es gegen die "Tags" kommerziell erhältliche Antikörper hoher Qualität gibt, erübrigt sich die mühsame Aufgabe, neue Antikörper herzustellen, und verschiedene "Tags" können verwendet werden, um nahe verwandte Protein zu unterscheiden. Gleichzeitig dient die Transformation der T-DNA-Knock-out-Mutanten als Komplementationstest für jeden abweichenden Phänotyp, der mit dem "Knock-out" assoziiert ist. Schliesslich wird ein neuer Ansatz zur Klärung des Problems der funktionellen Redundanz zwischen verschiedenen MAP-Kinasen in Arabidopsis vorgestellt, der auf der neuen Methodik basiert.

Mitogen-activated protein (MAP) Kinasen regulieren eine grosse Vielzahl an Prozessen in Eukaryoten, von abiotischen und biotischen Stressreaktionen bis hin zur Entwicklung. Die komplexe Natur dieser Prozesse ist an der Komplexität der Genfamilien erkennbar, die die Mitglieder der MAP-Kinase-Signaltransduktionskaskaden ausmachen. Wir sind gerade - in einem FWF-geförderten Projekt - dabei, T-DNA-Knock-out-Mutanten verschiedener Mitglieder der Arabidopsis-MAP-Kinase-Genfamilie zu analysieren. Mit 20 Mitgliedern ist die Familie sehr gross, und es ist deshalb ein grosses Problem, die Funktionen der verschiedenen Mitglieder zu unterscheiden. Im beantragten Projektvorschlag zielen wir in erster Linie darauf, das "epitope tagging" von MAP- Kinasen zu verwenden. Mittels eines neuen Ansatzes wird jede T-DNA-Knock-out-Linie mit ihrem eigenen Gen, das durch ein Epitop markiert ist und auch den eigenen Promotor inkludiert, retransformiert. Dieser Ansatz bietet mehrere Vorteile. Die Transkription vom eigenen Promotor aus stellt die korrekte zeitliche und räumliche Expression des Gens sicher und erhält dessen Stöchiometrie. Es gibt keine Konkurrenz zwischen dem endogenen Protein - das durch den Knock-out ausgeschalten wurde - und dem markierten Protein, so dass das markierte Protein für Lokalisierungsstudien, biochemische Tests und Protein-Protein-Interaktions-Untersuchen optimal geeignet ist. Da es gegen die "Tags" kommerziell erhältliche Antikörper hoher Qualität gibt, erübrigt sich die mühsame Aufgabe, neue Antikörper herzustellen, und verschiedene "Tags" können verwendet werden, um nahe verwandte Protein zu unterscheiden. Gleichzeitig dient die Transformation der T-DNA-Knock-out-Mutanten als Komplementationstest für jeden abweichenden Phänotyp, der mit dem "Knock-out" assoziiert ist. Schliesslich wird ein neuer Ansatz zur Klärung des Problems der funktionellen Redundanz zwischen verschiedenen MAP-Kinasen in Arabidopsis vorgestellt, der auf der neuen Methodik basiert.