Fluoreszierende T-DNAs und Pflanzen-Interphasenchromatin

Obwohl die komplette Sequenz der Erbsubstanz einiger Organismen, wie z.B. die der Pflanze Arabidopsis thaliana bereits bekannt ist, läßt sich aus dieser Information nur sehr wenig über die dreidimensionale Strukturierung der Erbsubstanz im Zellkern aussagen und ob, und wenn ja wie die Genexpression von der Architektur des Zellkerns möglicherweise abhängen könnte. Es ist denkbar, daß beides, sowohl die Position eines Chromosomes innerhalb des Zellkerns, als auch physikalsche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Chromosomen die Aktivität von Genen beeinflussen könnte. Vor kurzem entwickelte Methoden zur Sichtbarmachung von spezifischen Stellen im Genom im Interphasenzellkern von lebenden Zellen revolutionieren die Studien der Organisation und Dynamik des Interphasenchromatins. Eine Technik, die bis jetzt hauptsächlich auf Säugetier-, Hefe- und Drosophila-Zellen beschränkt blieb, basiert auf der Ausnutzung der hohen Bindungsaffinität zwischen bakterieller Operatorsequenz und entsprechendem Repressorprotein in Kombination mit modifizierten natürlich vorkommenden fluoreszierenden Proteinen um bestimmte chromosomale Stellen spezifisch zu markieren. Im Fluoreszenzmikroskop erscheinen so markierte DNA Stellen als fluoreszierende Punkte im Interphasenzellkern lebender, nicht fixierter Zellen. Die Möglichkeiten dieser Technologie für das Studium der Anordnung, Bewegung und Wechselwirkungen des Chromatins in lebenden Pflanzenzellen wurde noch kaum verwirklicht. Für diesen Zweck haben wir Vektoren konstruiert die einerseits auf dem tetracycline operator/repressor system und einem modifiziereten grün fluoreszierenden Protein (enhanced yellow fluorescent protein; EYFP) (tetYFP Konstrukt) beruhen, und andererseits auf dem lac operator/repressor system und einem modifizierten rot fluoreszierenden Protein (Discosoma sp. Red protein2; DsRed2) (lacRed Konstrukt). Eine Zahl von transgenen Arabidopsispflanzenlinien mit gelbgrün fluoreszierenden Punkten im Interphasezellkern konnten mit dem tetYFP Konstrukt bis jetzt bereits erzeugt werden. Unter lacRed Arabidopsispflanzen wird zur Zeit auf rot fluoreszierende Punkte in Ihren Interphasenzellkernen gesucht. An einer ausgesuchten Zahl von transgenen Linien, wo jedes Arabidopsischromosom mindestens einmal markiert ist werden die Positionen der Insertionsstellen im Interphasenzellkern studiert werden, und die Abstände zwischen allelischen und nicht allelischen Insertionsstellen über Zeit und in verschiedenen Pflanzengeweben bestimmt werden. Diese Aspekte der Organisation von Interphasenchromatin werden mit der Expression der Reportergene korreliert werden.

Arabidopsis thaliana ist die Modell Pflanze der Pflanzenmolekularbiologie. In diesem Projekt wurden Arabidopsis Pflanzen erzeugt, in deren Genom in Stellen, die wir genau bestimmen konnten, sich große Abschnitte von sich wiederholenden DNA Sequenzen befinden, an die sich fluoreszierende Proteine, die in den Pflanzenzellen gemacht werden, mit hoher Affinität binden: dadurch sind diese Stellen unter dem Fluoreszenzmikroskop als scharfe Punkte in den Zellkernen der Pflanzenzellen sichtbar. Dies erlaubt es uns die Verteilung und die Dynamik des Erbguts in diesen Stellen im Erbgut der Pflanzen in lebenden Zellen beobachten und vermessen zu können. Diese Daten sind ein Beginn von Untersuchungen über Einfluss der Organisation und Dynamik von Chromosomen auf die Expression genetischer Information in verschiedenen Zelltypen und unter sich ändernden Umwelteinflüssen. Wir bestimmten: (1) Abstände zwischen den auf diese Weise durch Fluoreszenz markierten Stellen während der Interphase, (2) bestimmten Abstände zwischen Stellen auf verschiedenen Chromosomen, (3) bestimmten Abstände zwischen Stellen auf dem gleichen Chromosom, (4) bestimmten die Beweglichkeit dieser Stellen in den Zellkernen und (5) bestimmten die räumliche Anordnung verschiedener Stellen zueinander. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Chromosomen dieser Pflanzen in Wurzelzellen (auf diesen Zelltyp beschränkten sich unserer Messungen) in der Interphase ziemlich statistisch verteilt und ungeordnet erscheinen. Die erzeugten Wurzellinien sind Voraussetzung für Untersuchungen der Organisation der Chromosomen in der Interphase, ihrer Expression und dynamischen Verhaltens in lebenden Zellen. Es besteht weltweites Interesse an unseren Linien.