Koagulationskontrollierende Glykoproteine

Die moderne Medizin nützt in steigendem Ausmaß die biologische Wirkung von Proteinen und Glykoproteinen durch gezielte Verabreichung derselben als therapeutische Präparate. Ein hoher Stellenwert kommt in diesem Umfeld der Gruppe von Proteinen zu, welche in die Regulation der Blutgerinnung involviert sind. Solche Proteine können über einen Fraktionierungsprozeß aus Plasma gewonnen oder über rekombinante Technologie hergestellt werden. In beiden Fällen ist die Deaktivierung von Viren und Pathogenen in den Präparaten von großer Wichtigkeit. Alle Protein Präparate, die als Therapeutika Einsatz finden sollen, bedürfen einer sorgfältigen Charakterisierung ihrer chemischen Struktur und ihrer funktionellen Eigenschaften. Dies ist erforderlich um den Produktionsprozeß zu kontrollieren, die strukturelle Integrität der Proteine und deren posttranslationale Modifikationen zu überprüfen und die Abwesenheit unerwünschter Modifikationen zu garantieren. Für diese Charakterisierung der chemischen Struktur von Proteinen und Glykoproteinen ist der Einsatz von miniaturisierten Hochleistungs-Trennmethoden kombiniert mit hochempfindlicher Massenspektrometrie die Methode der Wahl. Im vorgelegten Projekt wird eine direkt gekoppelte Kapillar-Hochleistungs-Flüssigkeits- Chromatographie (C-HPLC) und Kapillar-Elektrophorese (CE) mit Massenspektrometrie (MS) unter weichen Ionisationsbedingungen zum Einsatz kommen. Tandem-Massen-Analysatoren, mit deren Hilfe man eine Fragmentierung der Biomoleküle durch Kollision mit Edelgasmolekülen erreichen und analysieren kann, erlauben die direkte Kontrolle der Aminosäure Sequenz, das Auffinden einzelner modifizierter Aminosäuren und die Charakterisierung dieser Modifikationen, z.B. der in Glykoproteinen vorhandenen Kohlehydratstrukturen. Modifizierte Kohlehydratstrukturen können in erheblichem Maß für eine unerwünschte Immunantwort in Patienten verantwortlich sein. Eines der Ziele des vorgelegten Projektes wird es sein, die angesprochenen analytischen Methoden noch weiter zu verbessern und weiterzuentwickeln. Dies ist insbesondere dann notwendig, wenn man stark glykosilierte und stark modifizierte Proteine untersuchen will. Das zweite - und gleich wichtige - Ziel wird es sein, mit Hilfe dieser fortgeschrittenen analytischen Techniken eine detaillierte Charakterisierung der verschiedenen Isoformen von Antithrombin III und Blutgerinnungsfaktor IX zu erreichen. Diesen beiden Glykoproteinen aus Blutplasma kommt eine wichtige Funktion in der Regulation der Blutgerinnung zu, und beide werden als hoch aktive therapeutische Präparate zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen eingesetzt.

Das genannte Forschungsprojekt befasste sich mit einer detaillierten Analyse der Struktur zweier Glykoproteine, welche für die Kontrolle der Blutgerinnung von großer Bedeutung sind, d.s., Blutgerinnungsfaktor IX (FIX) und Antithrombin (AT). Erfasst wurden die Struktur der Peptidkette, der daran angebundenen Kohlehydratketten (Glykane) und allfällige weitere post-translationale Modifikationen. Beide genannte Glykoproteine werden als Therapeutika (Biopharmaka) eingesetzt, um angeborene oder erworbene Störungen der Blutgerinnung, welche auf eine Fehlfunktion dieser Glykoproteine zurückzuführen sind, durch Substitution zu behandeln. Beide Glykoproteine können aus menschlichem Spender-Plasma durch eine Abfolge von Reinigungs-, Konzentrierungs- und Pathogen- Deaktivierungs-Schritten gewonnen werden, oder alternativ über rekombinante DNA-Technik in Säugetierzelllinien erzeugt werden. Rekombinanten Technologien kommt für die Verfügbarkeit in hinreichender Menge und zu leistbaren Preisen eine wichtige Bedeutung zu. Glykosilierungsmuster in rekombinanten Glykoproteinen unterscheiden sich in vielen Fällen von den Mustern, wie sie im humanen Plasma vorkommen. Eines der Ziele dieses Projektes war es, die vorkommenden Glykoslierungsmuster (i.e., die Struktur der an den Proteinen angebundenen Kohlehydratketten, deren Positionsspezifität und deren Variabilität) von humanem plasmatischem AT und FIX zu bestimmen. Dieses Muster der plasmatischen Glykoproteine kann dann der Standard sein, mit dem die Muster der rekombinanten Proteine verglichen werden sollten. Die Ergebnisse dieses Projectes wurden in 6 wissenschaftlichen Veröffentlichungen und 6 Vorträge (sowie 3 Postern) bei internationalen Fachtagungen vorgestellt. Die wesentlichen Ergebnisse sind im Folgenden zusammengefasst. (i) Neben den Glykanstrukturen der beiden bislang bekannten Isoformen von AT konnten die Glykostrukturen von 5 weiteren Glykoformen erstmals aufgeklärt und in ihrer relativen Häufigkeiten bestimmt werden. Dabei wurden auch in plasmatischem AT fukosilierte Glykane mit einer rel. Häufigkeit von etwa 5 % gefunden. In bestimmten Verknüpfungsposition bilden fukosilierte Glykan-Strukturen antigene Epitope. Fukosilierung war bislang in plasmatischem humanem AT unbekannt, während es in den meisten rekombinanten AT Präparationen in hohem Ausmaß vorkommt (ii) Die Untersuchung der positionsspezifischen Variabilität der Glykosilierung ergab, dass fast alle Modifikationen positionsspezifisch vorkommen. AT ist daher als ein in seiner Glykostruktur relativ stark konserviertes Glykoprotein zu betrachten. (Dies kann als Hinweis darauf gesehen werden, dass im Fall von AT die Glykanstrukturen für die biologische Rolle vermutlich von sehr erheblicher Bedeutung sind.) (iii) Mit der detaillierten Aufklärung der Glykostrukturen von plasmatischem humanem Antithrombin wurde jener Referenz-Standard charakterisiert, auf den rekombinante AT Präparate, die als Therapeutika eingesetzt werden, Bezug nehmen müssen. (iv) Betreffend den Blutgerinnungsfaktor FIX wurde hingegen eine variantenreiche Glykosilierung am sogenannten Aktivierungspeptid gefunden. Hier treten neben N-gebundenen auch O-gebundene Glykane auf. Ein wesentlicher Teil des Forschungsprojektes war der Weiterentwicklung von chemisch-analytischen Methoden und Strategien gewidmet, welche eine Detailcharakterisierung von Glykoproteinen in einem Mengenbereich von g (Piko-Mol) erlauben. Dafür wurden on-line Kombinationen von Hochleistungstrennverfahren (insbesondere Kapillarelektrophorese und Affinitätschromatographie) mit Mehrstufen-Massenspektrometrie (MS) eingesetzt und weiterentwickelt. Besonders die Analyse von intakten Glykoproteinen mittels Kapillarelektrophorese-Elektrospray- Masenspektrometrie war eine beispielhafte Strategie, welche in der Zwischenzeit auch von anderen Gruppen zur Analytik anderer pharmazeutisch wichtiger Glykoproteine eingesetzt wurde und wird. Ein weiterer wichtiger methodischer Aspekt waren die Untersuchungen, in welcher Weise die Fragmentierungsmuster der Glyko- und Peptidstrukturen im Rahmen der Mehrstufen-MS von der Art der Ionisierung und den verschiedenen Fragmentierungsbedingungen (Ionenkühlung, Stoßenergie, etc.) beeinflusst werden. Auf der Basis dieser systematischen Untersuchungen wurden wichtige Erfahrungen für die Analyse von Glykanstrukturen mittels MS gesammelt und verbesserte Strategien zur Charakterisierung der Glykosilierung von Glykoproteinen entwickelt.