Spezifität einer PP2C Phosphatase Subfamilie

Proteinphosphatasen und -kinasen sind wichtige Schlüsselregulatoren in allen eukaryotischen Zellen. Diese Enzyme wurden in Hefe und in Säugetierzellen als wichtige Komponenten der Signaltransduktion charakterisiert und deren Involvierung in der Wachstumskontrolle und der Stressantwort untersucht. Wir isolierten eine Medicago sativa Proteinphosphatase vom PP2C-Typ, MP2C (Medicago P2C), als einen negativen Regulator in einem stressinduziertem MAPK (Mitogen-aktivierte Proteinkinase) Signalweg. Wir konnten das spezifischen Substrat, eine MAPK (SIMK), identifizieren, wobei ausschließlich SIMK aber keine anderen von uns getesteten MAPKs von MP2C inaktiviert wurden. Für weiterreichende Untersuchungen klonten wir das ein putatives MP2C Homolog (genannt AP2C) aus Arabidopsis thaliana und identifizierten sein Substrat AtMPK6 (ein homologes Protein von SIMK). Beide Phosphatasen, AP2C und MP2C, besitzen weiters an deren N-terminalen Ende ein Kinase-interagierendes Motif (KIM), welches bereits in mehreren Organismen für Proteine beschrieben wurde, die mit MAPK interagieren. Wir konnten mittels Domänenaustausch und spezifischer Mutagenese zeigen, dass KIM für die Bindung an die MAPK und deren Inaktivierung benötigt wird. In Arabidopsis gibt es vier nahe MP2C Homologe, die eine eigene Subfamilie in der großen Gruppe der PP2C Phosphatasen bilden. Alle vier besitzen eine KIM Domäne und wir nehmen daher an, das diese Phosphatasen in der Inaktivierung von MAPKs involviert sind. Die Zielsetzung dieses Antrags ist die physiologische Untersuchung dieser Arabidopsis PP2C Gruppe mit reverser Genetik, welche MAPK Signalwege durch bestimmte Phosphatasen beeinflusst werden. Um diese Fragen zu beantworten möchten wir die Interaktion und Inaktivierung verschiedener MAPKs mit diesen vier PP2C Phosphatasen testen und den Phänotyp und die MAPK Aktivität in PP2C Insertionsmutanten. Weiters möchten wir weitere Interaktionspartner suchen, welche Aufschluß über weitere mögliche Spezifitäten liefern könnten. Ein essentielle Eigenheit der Signaltransduktion ist die vorübergehende Aktivierung, welche auch für die Spezifität wichtig ist. Deshalb ist ein Verständnis der Inaktivierungsmechanismen ein äußerst aktuelles Ziel.

Stress in Pflanzen wird durch Steuerungsmechanismen vermittelt, in denen Proteinphosphorylierung entscheidend ist. Proteinphosphatasen spielen in diesen Prozessen essentielle Rollen, jedoch sind diese Enzyme bisher wenig erforscht. Daher konzentrierte sich unsere Arbeit auf die Analyse von zwei nah verwandten Phosphatasen der Modellpflanze Arabidopsis, mit dem Ziel, deren Eigenschaften und Aufgaben näher zu charakterisieren. Diese Aufgabenstellung wurde erfolgreich bewältigt und führte zu bemerkenswerten Entdeckungen, die das Forschungsgebiet der Signaltransduktion substantiell bereichern. Es stellte sich heraus, dass wichtige biologische Prozesse von zwei Phosphatasen des Typs 2C (PP2C) reguliert werden: Die Phosphatase AP2C1 reguliert die Wund- u. Pathogenabwehr, die Produktion von Abwehrmolekülen (die Stresshormone Ethylen und Jasmonsäure) und daraus folgend die Resistenzen gegenüber Herbivoren und Pilzen. Eine andere Phosphatase steuert die Entwicklung von Spaltöffnungszellen (Stomata), jene Zellen an der Blattoberfläche, die für den Gasaustausch der Pflanze mit ihrer Umwelt notwendig sind und dadurch die Balance an atmosphärischen Gasen (Sauerstoff, Kohlendioxid) beeinflussen. Mit Hilfe der Bioinformatik, zellbiologischen, biochemischen und molekularbiologischen Methoden, welche auch Arbeit mit Hefezellen involvierte, konnten wir die verwundungs- und pathogeninduzierte Phosphatase AP2C1 als eine Schlüsselkomponente in der pflanzlichen Stress-Signaltransduktion charakterisieren. AP2C1 kontrolliert die Aktivität von spezifischen Kinasen (phosphorylierende Enzyme) durch Interaktion und Dephosphorylierung. Daraus folgt ein Einfluss auf die verwundungsinduzierte Produktion des Stresshormones Ethylen und auf die pflanzliche Immunität gegenüber dem pathogenen Pilz Botrytis. Weiters entdeckten wir, dass AP2C1 die Menge an Jasmonsäure und die Resistenz gegenüber herbivoren Schädlingen beeinflusst: Pflanzen mit mutierter AP2C1 Phosphatase ("knock-out") weisen ein verändertes Expressionsmuster eines Stressmarkergens auf und zeigen erhöhte Resistenz gegenüber Spinnmilben. Bemerkenswert ist, dass diese Pflanzen kein verändertes Wachstumsverhalten aufweisen und spezifische Prozesse nur unter Stresseinfluss regulieren. Zusammengefasst haben wir die Phosphatase AP2C1 als neuen Schlüsselfaktor in der Stress- und Pathogenabwehr charakterisiert und eine neue Verbindung zwischen verwundungsinduzierter Phosphorylierung und Jasmonsäureproduktion bewiesen. Für zukünftige Forschungen schlagen wir eine detaillierte Analyse der Hormonbiosynthese in Arabidopsis mit Einbezug einer möglichen landwirtschaftlichen Verwertbarkeit vor. Darüber hinaus klären diese Ergebnisse Mechanismen und Komponenten der Stress-Signaltransduktion und der zellulären Entwicklung, welche sowohl in Pflanzen als auch in Säugetieren vorhanden sind.