Mitochondrien und Altern der Hefe

Seit etwa 10 Jahren hat das Interesse der wissenschaftlichen Gemeinschaft und die Intensität der Forschung auf dem Gebiet der experimentellen Alternsforschung enorm zugenommen. Dabei sind neben der medizinischen Alternsforschung und Alternsmedizin Modellsysteme für die Physiologie des Alterns, wie Drosophila, Caenorhabditis, Maus und die Hefe Saccharomyes cerevisiae immer wichtiger geworden. Dabei wurde deutlich, dass diese Modellsysteme, die alle Vorteile der modernen molekularen Genetik bieten, durchaus imstande sind, generelle und bei allen Eukaryoten nachweisbare Mechanismen des Alternprozesses aufzuklären. Wir zeigten, dass seneszente Hefe-Mutterzellen aber nicht junge Zellen in ihren Mitochondrien Sauerstoffradikale (ROS) entwickeln und eine Reihe weiterer Merkmale der Apoptose zeigen. Wesentlicher Inhalt dieses Projektes ist die Beantwortung der Frage, ob diese Sauerstoffradikale für den Alternsprozess notwendige Verursacher oder bloße Epiphänomene sind. Zur Beantwortung dieser Frage wollen wir drei Gruppen von Experimenten durchführen. I. Experimente zur mitochondrialen Physiologie alter Hefe-Mutterzellen sollen sowohl in vivo als auch "in organello" durchgeführt werden. Dabei werden mitochondriale und nukleäre Mutanten eingesetzt, die die Atmungskette, den ATP/ADP Transport oder die mitochondriale ATP-Synthese betreffen. II. Es sollen mit verschiedenen neuen Methoden Gene gesucht werden, die für den Alternsprozess wesentlich sind. Geplant ist eine genomweite Transkriptanalyse seneszenter Hefezellen und eine Untersuchung aller 4627 Gendeletionen (EUROSCARF) in nichtessentiellen Genen unter Bedingungen des oxidativen Stress. Eine klassische Mutantenanalyse wird in einem Stamm durchgeführt werden, bei dem die Mutterzelle lebt aber alle Tochterzellen wegen eines durch den mutterzellspezifischen HO-Promoter kontrollierten essentiellen Gens absterben. III. Die Rolle von Mutationen im Proteinkinase A (RAS/cAMP) Signalsystem im Alternsprozess und bei der Erzeugung von zellinternen Sauerstoffradikalen soll untersucht werden. Grundlage dafür sind unsere früheren Ergebnisse, die zeigen dass aktivierende Punktmutationen in RAS2 zu einer drastischen Verkürzung der Lebensspanne und zur Erzeugung zellinterner Sauerstoffradikale führen und neuere Untersuchungen, die zeigen, die Aktivierung von ras-Genen auch in menschlichen Zellen oxidativen Stress und Apoptose erzeugen.

Der Prozess des mutterzellspezifischen Alterns der Hefezellen wird seit einigen Jahren von einer großen Zahle von Arbeitsgruppen in Europa und in den USA untersucht. Der Grund für diese Renaissance der Hefe-Alternsforschung liegt darin, dass das einfache genetische System der Hefe die Möglichkeit gibt, effizient Alternsmechanismen zu studieren, die dann in anderen Modellsystemen des Alterns, wie z.B. der Maus oder in menschlichen Zellkulturen untersucht und überprüft werden können. Die wichtigsten Ergebnisse die im Projekt P16402 gewonnen wurden, werden hier zusammengefasst: i) Wir entwickelten eine neue Methode, um den muterzellspezifischen Lifespan (Lebensspanne, Lebenserwartung) von Hefezellen zu messen. Damit können wir nun eine große Zahl von Kandidatengenen testen, die auf Grund früherer Untersuchungen wahrscheinlich im Alternsprozess involviert sind. ii) Wir konnten zeigen dass Redoxprozesse und Redoxhomöostase eine zentrale Rolle im Alternsprozess spielt. Die Produktion von ROS (reactive oxygen species, Folgeprodukte der in der Zelle entstehenden Sauerstoffradikale) und die Abwehr der Zelle gegen ROS üben einen starken Einfluss auf den Lifespan aus. iii) Mutationen im ras-Onkogen der Hefe (einem hochkonservierten lebenswichtigen Gen, das auch im menschlichen Genom vorkommt) können Apotpose (programmierten Zelltod) und vorzeitiges Altern auslösen, wie dies auch in menschlichen Zellen beobachtet wurde. Wir zeigten durch Elektronen Spinresonanz-Messungen, dass in diesen Mutanten Sauerstoffradikale (Superoxid) sowohl in Mitochondrien als auch extra-mitochondrial gebildet werden. iv) Wir zeigten, dass die Stressphysiologie der Zelle eine wichtige Rolle im Alternsprozess spielt. Schäden an der DNA die durch eine Mutation im "origin recognition complex" ausgelöst werden, bewirken ROS-Produktion, Apoptose und die Aktivierung einer großen Zahl von Genen, die in ungestressten wachsenden Zellen normalerweise stillgelegt sind. v) Die asymmetrische Verteilung von Mitochondrien zwischen Mutter- und Tochterzelle im Zellzyklus wurde in gestressten und ungestressten Zellen untersucht. Entgegen unserer Erwartung fanden wir keine Asymmetrie der Verteilung der Mitochondrien. Jedoch wurde inzwischen gefunden, dass bestimmte zytoplasmatische Proteine nach oxidativem Stress in der Zellteilung asymmetrisch verteilt werden. vi) Wir benützten die globale Transkriptanalyse auf Microarrays um Kandidatengene zu identifizieren und untersuchten die Alternsphänotypen der entsprechenden Deletionsmutanten. Dadurch konnten wir zwei Gene (YKL056c und YGR076c) identifizieren, die bei Deletion den Lifespan der Hefe signifikant erhöhen. Beide kodieren für Proteine, die in oder an der Oberfläche von Mitochondrien lokalisiert sind. Eine genauere Untersuchung der Funktion dieser beiden Gene und Proteine erfolgt in dem Folgeprojekt beim FWF S9303-B05 und im Projekt MIMAGE im FP6 der EU. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass das mutterzellspezifische Altern der Hefe durch oxdiativen Stress gesteuert wird, der in Mitochondrien seinen Ursprung hat. Altern ist aber ein multifaktorieller Prozess und wir studieren auch den Zusammenhang unserer Ergebnisse mit anderen Theorien des Alterns, wie z.B. dem Einfluss von dietary restriction und von extrachromosomalen minicircles (ERCs, ein Molekül das in höheren Zellen nicht vorkommt und spezifisch für Hefe ist) auf den Lifespan.