Baeyer-Villiger Oxidation durch rekombinante Zellen

Biokatalyse ist eine kosteneffiziente und umweltfreundliche Methode zur Produktion von Feinchemikalien und repräsentiert einen Zugang der "Grünen Chemie" zu biologischen Wirkstoffen. Die Einführung von Enzymen als Katalysatoren in die synthetisch-organische Chemie hat viele neue hochenantioselektive Umsetzungen ermöglicht. Die Entwicklung von neuen biokatalytischen Transformationen hängt wesentlich davon ab, neue Biokatalysatoren zu finden. Daher stellen Identifikation, Charakterisierung und Entwicklung derartiger Systeme zur Zeit eine der zentralen Forschungsaktivitäten auf diesem Gebiet dar. Der Einsatz von Mikroorganismen ermöglicht Zugang zu Enzymen, die schwer in isolierter Form zu handhaben sind. Derartige Organismen stellen nachwachsende Quellen des gewünschten Biokatalysators und aller benötigten Kofaktoren dar. Daher sind Ganzzellsysteme erheblich einfacher zu verwenden, insbesondere für Chemiker ohne spezieller Ausbildung in Mikrobiologie. In natürlichen Zellen ist die Effizienz einer Biotransformation limitiert, da eine erhebliche Anzahl von anderen Enzymen existiert, die um Substrate konkurrieren können. Eine Lösung dieser Problematik stellen rekombinante Überexpressionssysteme dar, die erheblich günstigere Mengenverhältnisse von gewünschtem Enzym zu anderen katalytisch aktiven Zellbestandteilen aufweisen. Ein Hauptziel dieses Projektes ist es, einfach zu handhabende Biokatalysatoren für Baeyer-Villiger Oxidationen zur Verfügung zu stellen, die ein vorhersagbares Reaktivitätsmuster aufweisen sowie eine breite Palette an Verbindungen umsetzen. Substratakzeptanzprofile neuer Baeyer-Villigerasen zu erstellen, die die Evaluierung großtechnischer Anwendungen erlauben, erfordert schnelle Screening-Verfahren insbesondere der Chemo- und Enantioselektivität. Derartige analytische Hochleistungssysteme erfordern den Einsatz von umfassenden Substanzbibliotheken. Biotransformationen mit rekombinanten Zellen werden massenspektroskopisch ausgewertet, wodurch ein hoher Grad der Automation erreicht werden kann. Markierungstechniken ermöglichen die rasche Bestimmung der Enantioselektivität des Überexpressionssystems. Die Methodenentwicklung des analytischen Verfahrens wird daraus ausgelegt sein, auf andere enzymatische Systeme ausgeweitet zu werden. Die von den untersuchten Stämmen erhaltenen chiralen Produkte werden dazu verwendet werden, neue Synthesestrategien zu biologisch wirksamen Substanzen mit pharmazeutischer Relevanz zu aufzuzeigen. Ein Schwerpunkt liegt dabei auf der Entwicklung umweltfreundlicher Darstellungswege insbesondere von Wirkstoffen zur Behandlung von Krebs und Viruserkrankungen.

Biokatalyse bietet eine umweltverträgliche Alternative für "grüne" Oxidationsprozesse, da die beteiligten Katalysatoren (Enzyme, Mikroorganismen) vollständig biologisch abbaubar sind und molekularer Sauerstoff als Oxidans verwendet wird. Bedingt durch die limitierte Stabilität von Oxygenasen und deren Kofaktor-Abhängigkeit bieten rekombinante Ganz-Zell-Biotransformationen eine einfache Anwendungsmöglichkeit für derartige Reaktionen. Dieses Projekt hatte zum Ziel, jene Beschränkungen, die eingangs dieses Jahrzehnts auf dem Gebiet der enzymatischen Baeyer-Villiger Biooxidation existierten, zu überbrücken. Eine Vielzahl neuer Baeyer-Villiger Monooxygenasen (BVMOs) wurde durch den Fortschritt in der Genom-Entschlüsselung zugänglich. Bislang basierten jedoch die Mehrzahl der Studien für Baeyer-Villiger Biotransformationen auf sehr wenigen Enzymen und das Potential von BVMOs für die Synthesechemie war unklar. Durch die Entdeckung diverser neuer Enzyme war eine effiziente Strategie zur Identifikation der biokatalytischen Eigenschaften dieser BVMOs gefordert. Somit trat dieses Projekt mit drei Schwerpunkten an: (i) Entwicklung eines parallelen Screening-Verfahrens für Substrat-Akzeptanzstudien neuer BVMOs; (ii) Demonstration der Vielseitigkeit von neuen BVMOs für die Synthese von Natur- und Wirkstoffen; (iii) Ausweitung der Darstellung chiraler Lactone auf Gramm-Maßstab unter Anwendung von rekombinanten E.coli Expressionssystemen in Laborfermentationsanlagen. Mit den erzielten Ergebnissen konnte ein überaus vielversprechendes Potential für biokatalytische Oxidationsprozesse, insbesondere für die Baeyer-Villiger Reaktion, dargelegt werden. Im Rahmen der Arbeit wurden mehrere neue BVMOs hinsichtlich ihrer Stereoselektivität und Substratakzeptanz charakterisiert. Ein wesentlicher Beitrag war hier die Identifikation von zwei Gruppen cycloketon-akzeptierender BVMOs, die antipodale Lactone generieren. Zugang zu beiden optischen Formen eines gewünschten Produktes stellt einen Schlüsselaspekt in der pharmazeutischen Wirkstoffsynthese dar. Während des Projektes wurde eine Substanz-Bibliothek in Kombination mit einem parallelen GC- Screeningverfahren entwickelt, das die Beurteilung des katalytischen Repertoires einer neuen BVMO binnen Tagen unter Verbrauch von mg-Mengen an Substrat ermöglicht. Diese Technologie wurde für die Erstellung von Substratprofilen sowohl für Wildtyp- als auch Mutanten-BVMOs eingesetzt, die von Kooperationspartner bereitgestellt wurden. Um schließlich die Anwendbarkeit von Ganz-Zell Baeyer-Villiger Reaktionen darzulegen, wurde das Up-scaling in Fermentationsanlagen umgesetzt, um letztendlich Gramm-Mengen für spätere chemische Umsetzungen verfügbar zu machen. Zufriedenstellende Resultate wurden mittels einer Festphasen-Reservoire Technologie von einem Kooperationspartner erzielt. Zusammenfassend wurde die mikrobielle Baeyer-Villiger Biotransformation erfolgreich vom analytischen Maßstab bis hin zu präparativen Quantitäten realisiert.