Raffinose-Oligosaccharide in keimenden Samen

Oligosaccharide der Raffinose-Reihe sind neben Saccharose die bedeutendsten löslichen Zucker in Pflanzen- Samen. In der Pflanzenzüchtung wird versucht, den Gehalt an Raffinosen herabzusetzen, weil sie vom Mensch und wichtigen Nutztieren nicht verdaut werden können und daher als unverträglich gelten. Allerdings ist die Bedeutung dieser Zucker für die Pflanzen noch unklar. Raffinosen werden in den Samen fast aller Pflanzenarten gespeichert, obwohl sie in Blättern und Wurzeln oft fehlen. Im Gegensatz zu diesen Pflanzenorganen können Samen in fast trockenem Zustand oft jahrelang überleben und anschließend keimen. Die Speicherung von Raffinosen könnten daher sowohl für die Austrocknungs-Toleranz als auch für die Keimfähigkeit notwendig sein. Während eine Rolle von Raffinosen als zelluläre Schutzstoffe während der Austrocknung trotz intensiver Forschungsanstrengungen ungeklärt ist, wurde die Bedeutung von Raffinosen als Reservesubstanzen für die Keimung bislang kaum untersucht. Während der Keimung werden Raffinosen sehr schnell aufgebraucht, meist bevor die Haupt-Reserven wie Protein, Stärke und Öle angegriffen werden. Welche molekularen Mechanismen den Abbau der Raffinosen auslösen und über welche Stoffwechsel-Prozesse ihre Abbauprodukte verwendet werden ist unbekannt. Zielsetzung dieses Forschungsprojektes ist es, diese für die Samenphysiologie zentralen Fragen zu klären. Dafür sollen die Enzyme und die entsprechenden Gene, die für die Mobilisierung der Raffinosen verantwortlich sind, charakterisiert werden. Weiters soll untersucht werden, wo innerhalb der Zellen dieser Abbau vonstatten geht und wie der Prozess gesteuert wird. Der Abbau der Raffinosen soll mittels Inhibitoren gegen Schlüsselenzyme gezielt blockiert und die sich daraus ergebenden Auswirkungen auf Keimung und Wachstum sollen untersucht werden. Schließlich soll geklärt werden, ob die keimenden Samen molekulare Sensoren für die Abbauprodukte von Raffinosen besitzen, über die ihre Verwertung für Wachstum oder Atmung gesteuert werden könnte. Daher wird dieses Forschungsprojekt nicht nur dazu beitragen, die Bedeutung von Raffinosen im Stoffwechsel von Pflanzen zu verstehen, sondern auch Einblicke in sehr frühe zelluläre Geschehnisse während der Keimung gewähren, die nach wie vor einer der geheimnisvollsten Abschnitte im Leben einer Pflanze ist.

Raffinose Oligosaccharide (RFOs) sind Kohlenhydrate die in allen Pflanzensamen zu finden sind. Sie sind für die Austrocknungstoleranz und Langlebigkeit von reifen trockenen Samen von Bedeutung und werden währen der Keimung schnell abgebaut. Im Rahmen dieses Projektes haben wir die Bedeutung der RFOs für die Keimung untersucht und die im Abbau involvierten Enzyme, die so genannten a-Galactosidasen, näher untersucht. Mit Hilfe eines spezifischen a-Galactosidase Inhibitors, konnten wir erstmals nachweisen, dass RFOs während der Keimung die primäre Energie- und Kohlenstoffquelle darstellen. So keimten im Vergleich zu den Kontrollen nur ca. 25% der mit Inhibitor behandelten Erbsensamen. Um zu zeigen, dass der Abbau der RFOs die notwendige Energie zur Keimung liefert, wurden Samen gemeinsam mit dem Inhibitor und entweder Saccharose oder Galaktose (die Produkte des RFO Abbaus) inkubiert. Interessanterweise konnte der inhibierende Effekt nur durch die Zugabe von Galaktose, nicht aber durch Saccharose aufgehoben werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die RFOs nicht nur die zur Keimung notwendige Energie zur Verfügung stellen, sondern die durch den RFO Abbau entstehende Galaktose auch als Signalstoff für den Ablauf der Keimung verantwortlich ist. In einem weiteren Teil des Projektes war es uns möglich zwei unterschiedliche -Galactosidasen aus Erbsensamen zu klonieren und zu charakterisieren, und ein Modell, das den Abbau der RFOs beschreibt, zu erstellen. Saure a- Galactosidasen werden während der Samenreifung synthetisiert und in Vakuolen akkumuliert, während die gebildeten RFOs im Zellplasma zu finden sind, wo sie Proteine und Membranen während der Austrocknung schützten können. Im Zuge der Quellung werden RFOs aus dem Zellplasma in die PSVs transportiert und dort von den sauren a-Galactosidasen abgebaut, welche etwa 50% der RFO mobilisieren. Erst danach werden die basische a-Galactosidasen synthetisiert, die dann für den Abbau der restlichen im Zellplasma befindlichen RFOs verantwortlich sind. Saure und basische a-Galactosidasen werden also nicht nur zeitlich versetzt aktiv, sie befinden sich auch in unterschiedlichen Kompartimenten der Zelle. Zusammenfassend konnten wir zum ersten Mal beweisen, dass zwei Klassen von Galaktosidasen in ein und denselben Samen aktiv sind und dass diese Enzyme sequentiell und koordinierten am Abbau von Raffinose- Oligosacchariden beteiligt sind.