Protein C Inhibitor und Lipide

Serpine (Serin-Protease-Inhibitoren) sind eine Familie verwandter Glykoproteine, zu welchen nicht nur Inhibitoren proteolytischer Enzyme zählen, sondern auch "nicht-hemmende" Mitglieder mit anderen biologischen Funktionen, wie z.B. der Hormon-Vorläufer Angiotensinogen oder die Hormon-bindenden Proteine Thyroxin-bindendes Globulin und Corticosteroid-bindendes Globulin. Meine Arbeitsgruppe befaßt sich seit langem mit mit der Analyse der biologischen Funktion von Protein C Inhibitor (PCI). PCI ist ein "hemmendes Mitglied" der Serpinfamilie, das in vielen Geweben synthetisiert und sezerniert wird und dementsprechend in vielen Körperflüssigkeiten vorkommt. PCI ist ein sehr unspezifischer Inhibitor und hemmt nicht nur aktiviertes Protein C, sondern auch viele andere intra- und extravaskuläre Proteasen. Bislang ist seine biologische Bedeutung unklar. Es ist uns vor kurzem gelungen, Mäuse zu generieren, in welchen das PCI-Gen inaktiviert ist. Diese PCI knockout Mäuse waren bei der Geburt normal, sie entwickelten sich auch weiterhin normal und waren gesund. Männliche homozygote PCI-/-Mäuse waren jedoch unffruchtbar aufgrund einer gestörten Spermienentwicklung. Der Befund, daß PCI-/-Mäuse sonst keinerlei Abnormitäten aufwiesen, war für uns insoferne nicht überraschend, als genauere Analysen ergaben, daß PCI in der Maus fast ausschließlich im Reproduktionstrakt synthetisiert wird. Somit ist allerdings die Rolle von PCI im humanen System nach wie vor unklar. Wir konnten in einem früheren Projekt zeigen, daß PCI spezifisch Retinoide bindet. Retinoide sind Abkömmlinge des Vitamin A, die eine Rolle spielen in der Regulation von Prozessen wie der Differenzierung und Entwicklung. Außerdem konnten wir Befunde erarbeiten, die zeigen, daß PCI von Leukozyten internalisiert und in den Zellkern transloziert werden kann. Diese Daten weisen darauf hin, daß PCI nicht nur extra- sondern auch intrazelluläre Funktionen hat, die möglicherweise etwas mit der Signalfunktion von Retinoiden (und auch möglichen anderen PCI-bindenden Lipiden) zu tun hat. Im vorliegenden Projekt möchten wir daher die Wechselwirkung von PCI mit Retinoiden und anderen Lipiden, insbesondere Fettsäuren, und deren biologische Relevanz analysieren. Wir werden die Retinoid-Bindungsstelle innerhalb des PCI Moleküls bestimmen und untersuchen, ob auch andere Lipide an diese Stelle binden. Außerdem möchten wir untersuchen, ob PCI die Aufnahme von Retinoiden in Zellen oder die Signalfunktion von Retinoiden beeinflußt, bzw. ob Retinoide die Aufnahme von PCI in Zellen und seine Translokation in den Zellkern beeinflussen. Im weiteren wollen wir dann Effekte von PCI-bindenden Lipiden in Organkulturen untersuchen, wobei wir vor allem Unterschiede in Organen von wildtyp-Mäusen (enthalten PCI) und PCI-knockout Mäusen analysiern wollen. Insgesamt sollen unsere Untersuchungen Aufschluß über die biologische Relevanz der Retinoid/Lipid-Bindung durch PCI geben.

Protein C Inhibitor (PCI) ist ein sezernierter, unspezifischer Proteaseinhibitor vom Serpin (Serinproteasen- Inhibitor)-Typ. PCI gehört zur Gruppe der Heparin-bindenden Serpine, und seine Aktivität und Wirkspezifität wird durch Heparin moduliert. Die physiologische Bedeutung von PCI ist bislang ungeklärt. In Vorprojekten konnten wir zeigen, dass PCI Retinoide bindet. Ziel des vorliegenden Projektes war es daher, die Wechselwirkung von PCI mit Lipiden generell zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass PCI spezifisch und mit hoher Affinität bestimmte Phospholipide bindet, und zwar oxidiertes Phosphatidyläthanolamin (OxPE), Phosphatidylserin (PS) und oxidiertes Phosphatidylserin (OxPS). Weiters konnten wir zeigen, dass die Hemmaktivität von PCI gegenüber aktiviertem Protein C, Thrombin und Urokinase durch die Phospholipidbindung stimuliert wird, während die Inaktivierung von Gewebekallikrein durch PCI in Gegenwart von OxPE, PS und OxPS dosisabhängig gehemmt wird. Der Effekt der Phospholipide ist somit dem Effekt von Heparin sehr ähnlich. Wir untersuchten daher die Hypothese inwieweit die Heparinbindungsstelle des PCI (H-Helix) an der Bindung von Phospholipiden beteiligt ist. Wir stellten eine rekombinante PCI-Mutante her, in welcher Aminosäuren deletiert waren, die für die Heparinbindung notwendig sind. Diese Mutante zeigte keine Bindung an immobilisierte Phospholipide. Sie hemmte nach wie vor aktiviertes Protein C, ihre Aktivität konnte jedoch weder durch Heparin noch durch Phospholipide stimuliert werden. Weiters konnten wir zeigen, dass ein Peptid, dessen Sequenz derjenigen der Heparinbindungsstelle des PCI entspricht, nicht nur den stimulierenden Effekt von Heparin dosisabhängig hemmte, sondern auch den von Phospholipiden. Daraus schließen wir, dass die Heparinbindungsstelle des PCI auch für die Bindung von Phospholipiden verantwortlich ist. Die von uns untersuchten PCI-bindenden Phospholipide sind normalerweise in vivo für PCI nicht zugänglich. Sie können aber an apoptotischen Zellen (PS) oder im Rahmen entzündlicher Prozesse (Oxidation von Phospholipiden) exponiert werden. Um festzustellen, inwieweit eine Bindung von PCI an Phospholipide auch in vivo stattfindet, untersuchten wir immunhistochemisch atherosklerotische Plaques. Es zeigte sich, dass in diesen tatsächlich PCI und Annexin V, ein PS-bindendes Protein, colokalisiert sind. Weiters untersuchten wir den Effekt von PCI auf die Phagozytose von PS exponierenden, apoptotischen Zellen durch Macrophagen. Mittels flow cytometry konnten wir feststellen, das dieselben Zellen, die PS exponieren auch PCI binden. Erste vorläufige Untersuchungen weisen ferner darauf hin, dass die Bindung von PCI an apoptotische Zellen deren Beseitigung durch Phagocytose stimuliert. Geplante zukünftige Untersuchungen sollen daher klären, welche Bedeutung die Bindung von PCI an Phospholipide in vivo hat.