Analyse des Histon-Code: Histon-Demethylasen

Die DNA ist im Zellkern mit basischen Kernproteinen, den Histonen, in Nukleosomen organisiert, die die Grundstruktureinheit des Chromatins darstellen. Durch Umfaltung und Modifikation des Chromatins werden entscheidende Vorgänge, wie die Expression von Genen, die Replikation der DNA, die Reparatur von DNA sowie Rekombinationsvorgänge reguliert. Einen wesentlichen Bestandteil dieser Regulationsmechanismen stellt der sogenannte epigenetische "Histon-Code" oder die Histon Sprache dar, darunter versteht man die spezifischen Signale und Markierungen, die durch Enzyme, wie Histon-Acetyltransferasen, Histon-Deacetylasen, Histon- Methyltransferasen, Histon-Demethylasen u. a. gesetzt werden. Die verschiedenen Elemente des Histon-Code stellen eine wichtige Ebene der Regulation dar, bei deren Störung es zu Krankheiten, u.a. bestimmten Fällen auch zur Cancerogenese kommen kann. So stellen Inhibitoren der beteiligten Enzyme, wie z.B. Histone-Deacetylase Hemmstoffe, wirksame Substanzen für die Therapie aber auch die Chemoprophylaxe von Krebserkrankungen dar. Unser Verständnis des Zusammenspiels der unterschiedlichen Histonmodifikationen ist noch sehr bruchstückhaft, wobei eine Entschlüsselung des epigenetischen Histon-Codes eine der grossen Herausforderungen der molekularen Biologie und Medizin darstellt. Das vorliegende Projekt beschäftigt sich mit einem Element des Histon-Code, nämlich mit der Charakterisierung, Reinigung und Identifizierung von Histon-Demethylasen, die bisher zwar postuliert, aber noch nicht molekular identifiziert sind. Histon-Methyltransferasen wurden in den letzten zwei Jahren in grosser Zahl beschrieben, wobei sich eindeutige Zusammenhänge zwischen Histon-Acetylierung, DNA-Methylierung und Histon-Methylierung ergaben. Vorarbeiten in kultivierten Mauszellen, die wir in den letzten Monaten durchführten, ergaben eindeutige Hinweise auf das Vorhandensein von Histon-Demethylasen; nach enzymatischer Charakterisierung, Vorversuchen zur Reinigung und Etablierung eines indirekten Enzym-Aktivitäts-Assays soll nun versucht werden, eine oder mehrere Demethylasen zu reinigen, mögliche Komplexpartner zu charakterisieren, die für die katalytische Einheit kodierenden Gene zu isolieren und eine oder mehrere Histon-Demethylasen in enzymatisch aktiver Form rekombinant zu exprimieren, um so genügend Material zur Etablierung eines einfachen und verlässlichen Assays zu gewinnen sowie die Voraussetzung für weitere funktionelle Studien in transfizierten Zellinien zu schaffen.

Das eukaryontische Genom enthält in Form der DNA die Information für den Aufbau von Zellen in Geweben und Organen. Während der Entwicklung eines Organismus bzw der Differenzierung von Zellen bestimmen weitere Informationselemente den funktionellen Zustand der Zelle. Diese "epigenetische" Information wird einerseits durch Methylierung der DNA selbst andererseits durch Veränderung der Nukleosomen und das Anbringen von Signalen an nukleosomalen Histonen des Chromatins eingebracht. Daraus hat sich die Bezeichnung "epigenetischer Histon Code" bzw "Chromatin Code" entwickelt, im Gegensatz zum genetischen Code der DNA. Posttranslationale Modifikationen von Histonen stellen ein zentrales Element des Histon Code dar. Die am besten untersuchte Modifikation ist die Acetylierung, die durch Histon-Acetyltransferasen und Deacetylasen katalysiert wird. Unsere Arbeitsgruppe beschäftigt sich seit mehr als zwei Jahrzehnten mit diesen Enzymen und deren Bedeutung. Eine weitere Modifikation, die Methylierung von Arginin- und Lysin-Resten an den Histonen, hat vor allem während der letzten Jahre sehr viel wissenschaftliche Aufmerksamkeit erregt. Als wir im November 2002 dieses Projekt begonnen haben, waren zwar mehrere Histon-Methyltransferasen identifiziert und charakterisiert, aber kein Enzym, welches die Methylierung revertiert. Wir hatten zu dieser Zeit aufgrund eines indirekten Immunoblot-Assays sehr konkrete Hinweise auf die Existenz solcher Histon-Demethylasen. Tatsächlich wurden dann Ende 2004 zwei Enzyme identifiziert, nämlich eine wirkliche Histon-Demethylase, die einen bestimmten Lysinrest am Histon H3 demethyliert, und ein zweites Enzym, das methyliertes Arginin in Citrullin überführt und damit die Methylierung auslöscht, allerdings unter Zurücklassung einer anderen Aminosäure. In unserem Projekt konzentrierten wir uns auf die Etablierung eines chromatographischen Reinigungsschemas, mit dem wir aus Mauszellen in Kultur zwei Demethylase-Aktivitäten unterschiedlichen Molekulargewichtes reinigen konnten, die sich deutlich in den Substratspzifitäten unterscheiden. Mittels 6 verschiedener Säulenchromatographien konnten wir einen hochmolekularen Demethylase Komplex reinigen, den wir momentan weiter charakterisieren. Interessanterweise finden wir in Nukleoli einen 1,3 MDa grossen Komplex, der nicht nur eine Histon-Demethylase Aktivität enthält sondern auch die Histone-Deacetylase HDAC1, was die enge Vernetzung der einzelnen Histon- Modifikationen im Sinne des epigenetischen Histon-Code unterstreicht.