Neuartige Herstellung attenuirter Influenza B Viren

Dieser Projektantrag presentiert eine neue Idee zur Herstellung attenuierter Influenza B Viren aus tierischer Zellkultur, unter Verwendung von Baculoviren als Transport- und Expressionsvehikel. Die Entwicklung moderner Influenza-Lebendimpstoffe erfordert genaue und langwierige genetische Studien, die zur Etablierung attenuierter Master-Stämme führen. So ermöglichte der Einsatz gentechnischer Methoden die Herstellung eines stablilen, attenuirten Influenza A Virus Lebendimpfstoffes. Ähnliche Strategien konnten jedoch bis jetzt für Influenza B Viren noch nicht erfolgreich werwendet werden, einerseits, weil es für diese Methode bestimmter temperatursensitiver Mutanten bedarf, die es als Influenza B Viren nicht gibt, andereseits wegen nicht vorhandener molekularbiologischer Werkzeuge. Das Influenzavirusgenom besteht aus einzelsträngiger RNA, welche als Negativstrang vorliegt und ca 13500 Nukleotide lang ist. Das Genom von Influenza A und B -viren ist in acht RNA-Segmente unterteilt, welche insgesamt für neun Strukturproteine und ein nichtstrukturelles Protein kodieren. Unser Ziel ist es, infektiöse Influenza B viren rekombinant herzustellen, und gleichzeitig Klonierungsvektoren verfügbar zu machen, die zur Produktion attenuierter Influenza B Viren dienen, sowie zu spezifischen genetischen Veränderungen (Antigen-Präsentation). Baculoviren können neben Insektenzellen auch zur effizienten Transduktion von Säugetieren verwendet werden. Rekombinante Baculoviren sind relativ einfach herzustellen, wobei es möglich ist mehrere, verschiedene Gene in ein virales Genom einzufügen. Aus diesem Grund eignen sich diese Viren zur Expression von Partikeln, die aus mehreren Komponenten bestehen, sowie Viren oder "Virus like particles". Diese Strategie soll nun dazu dienen, alle Influenza B Virus-Gene in Verozellen zu exprimieren. Durch die Herstellung geigneter Baculovirusvektoren, sollen infektiöse Influenza B Virus Partikel gewonnen werden und für weitere genetische Manipulation zur Verfügung stehen (z.B.: zur Attenuierung, Austausch antigener Sequenzen). Aufgrund unserer bisherigen Arbeiten mit Baculovirusesxpressionssystemen und Insektenzellkultur während der letzten Jahre, sowie unsere bisherigen Enwicklungen auf dem Gebiet attenuierter Influenza A Virus-Impstoffe, stehen uns alle notwendigen Werkzeuge und Expertisen zur Verfügung, die für dieses Projekt notwendig sind. Wir glauben, daß unser Ansatz dazu beitragen wird, zunächst den Mechanismus von Influenza B Viren näher zu erforschen, solche Viren rekombinant herzustellen, und neuartige, sichere Lebendimpfstoffe für Influenza und ähnliche virale Krankheiten zu entwickeln.

Influenzaepidemien beeinträchtigen wirtschaftliche und soziale Aktivitäten und verursachen Tausende von Todesfällen jedes Jahr. Besonders gefährdet sind Kinder und ältere Leute, bei denen die jährlichen Epidemien verheerende Folgen haben können. Obwohl inaktivierte Influenzaimpfstoffe zur Verfügung stehen, ist deren immunologischer Schutz oft nicht zufriedenstellend. Die Entwicklung von effizienteren Lebendimpfstoffen ist deshalb eine vielversprechende Möglichkeit Influenzaerkrankungen zu verhindern und kontrollieren. Aufgrund der häufigen Mutationen im Hüllprotein der Influenzaviren und der Tatsache, dass einzelne Gensegmente zwischen zwei Stämmen ausgetauscht werden können, muss jedes Jahr ein neuer, angepasster Impfstoff hergestellt werden. Effiziente Methoden sind dabei unumgänglich. Um möglichst sicher und schnell Influenza-Lebendimpfstoff herzustellen, bedarf es eines Gentransfersystems, das flexibel und effizient ist. Benötigte Influenzavirusgene können in Säugetier-Zellen eingeschleust werden wodurch intakte Influenzaviruspartikel hergestellt werden, die aufgrund von gezielten Deletionen abgeschwächt sind (attenuiert) und als Lebendimpfstoff zur Verfügung stehen sollen. Als neuartiges Gentransfersystem wurde ein Insektenvirus (Baculovirus) verwendet, welches in Säugetierzellen eindringen kann, dort aber nicht vermehrungsfähig ist. Es handelt sich also um ein reines Transfersystem, das schneller, effizienter und sicherer ist als bisherige Methoden. Baculoviren sind leicht genetisch zu verändern und so wurden Viren hergestellt die jeweils eines der insgesamt acht Influenzagene besitzen. Ein zusätzliches Baculovirus wurde hergestellt, bei dem das Reportergen "Green Fluorescent Protein" in negativer Orientierung von Influenza B-Virus flankierenden Sequenzen (Promotor) umgeben ist. Mit Hilfe dieses Baculoviruskonstrukts konnte die Funktionalität der vier Influenza Virus-Polymerasegenen gezeigt werden. Ein gleichzeitiger Gentransfer (Co-Transduktion) von acht verschiedenen Baculoviren war erfolgreich und führte zur Produktion infektiöser Influenzaviren. Damit wurde der "Proof of Concept" erbracht und eine neuartige Herstellung von Influenzaviren erschlossen und verfügbar gemacht.