Ultrastrukturelle Grundlagen Aktin-basierter Mobilität

Die Motilität von Zellen ist wesentlicher Bestandteil des Lebens; sie wird vom regulierten Auf- und Abbau von Teilen des Aktin-Cytoskeletts vermittelt. Ein essentieller Vorgang in der Bewegung von Zellen ist der Vorschub dünner cytoplasmatischer Strukturen, die als Lamellipodien bezeichnet werden. Die Grundlage dieses Vorschubs ist die gerichtete Polymerisation von Aktin-Filamenten zusammen mit ihrer Organisation in Netzwerke und Bündel; das Interesse der Wissenschaft richtet sich derzeit vor allem auf die Aufklärung dieser Vorgänge auf molekularer und struktureller Ebene. Die Erforschung der strukturellen Grundlagen dieser Vorgänge erfordert den Einsatz von Elektronenmikroskopie (EM): Damit wird die Untersuchung der Anordnung und Interaktion der Filamente sowie die Lokalisierung von Proteinkomplexen mit struktureller oder signalübertragender Rolle möglich. Aufgrund der unterschiedlichen Ergebnisse, die die Anwendung verschiedener Präparationstechniken für EM erbracht hat, ist jedoch eine Kontroverse über die Organisation der Aktinfilamente in Lamellipodien und damit über die Grundlagen ihres Vorschubs entstanden. Aus diesem Grund ist die Anwendung von Präparationstechniken erforderlich, die alle Schritte umgehen, die potentiell für Veränderungen in der Organisation der Aktinfilamente verantwortlich sein könnten. In einem Pilotprojekt ist es uns gelungen, das Potential von Cryo-EM für die Untersuchung der Aktinfilamente im Cytoskelett zu zeigen. Im Rahmen des hier vorgeschlagenen Projekts soll den Einsatz dieser Technik für die Visualisierung des Cytoskeletts in Lamellipodien ausgeweitet und mit der Lokalisierung Aktin-assoziierter Moleküle kombiniert werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sollen zu einem besseren Verständnis Aktin-basierter Zellmotilität führen.

Das Ziel dieses Projekts war es, neue Einblicke darüber zu gewinnen, wie sich Zellen bewegen. Die Kräfte, die Zellbewegung vorantreiben, entstehen durch die kontrollierte Reorganisation jenes Filamentsystems, das als "Actin- Cytoskelett" bezeichet wird. Dieses besteht aus einzelnen Filamenten, die die Fähigkeit haben, durch Polymerisation zu "schieben" oder durch die Interaktion mit dem kontraktilen Protein Myosin zu "ziehen". Im ersten Teil dieses Projekts haben wir die Frage untersucht, wie Filamente am vorderen Rand der Zelle "schieben" und uns dabei auf die Aufklärung der dreidimensionalen Organisation der sich aktiv vorschiebenden Regionen der Zelle, die als Lamellipodien bezeichnet werden, konzentriert. Um mögliche Veränderungen in der Struktur durch Präparationsmethoden der konventionellen Elektronenmikroskopie zu vermeiden, haben wir unsere Anstrengungen auf Strukturaufklärung mit Hilfe der neu aufkommenden Technik der cryo-Elektronentomographie (cryo-ET) konzentriert, in der Zellen schnell gefroren und in vitrifiziertem Eis untersucht werden. Durch die Aufnahme von zahlreichen Projektionen bei verschiedenen Kippwinkeln der Probe kann die dreidimensionale Organisation über Reprojektionsalgorithmen rekonstruiert werden. Dieser Ansatz erforderte die Entwicklung geeigneter Zellmodelle auf Trägerfilmen für cryo-EM, für die Korrelation von Lichtmikroskopie mit Elektronenmikroskopie und zur Bewertung von Gefrierprozeduren. Da in Österreich noch kein Elektronenmikroskop mit der Möglichkeit für cryo- ET existiert, wurden diese Untersuchungen am Europäischen Laboratorium für Molekularbiologie in Heidelberg durchgeführt, wo ab Sommer 2004 eine entsprechendes Mikroskop zur Verfügung stand. Umfangreiche Tests haben gezeigt, dass unfixierte Zellen durch den Blottingschritt, der zur Entfernung überschüssiger Flüssigkeit vor dem Frieren notwendig ist, großteils lysiert werden. Aus diesem Grund wurde cryo-ET vorerst mit chemisch fixierten und anschliessend gefrorenen Zellen durchgeführt. Eine Serie von Tomogrammen wurde erstellt; ihre Analyse läuft derzeit. In einem zweiten Teil haben wir neu entwickelte Techniken zur Korrelation von Licht- und Elektronenmikroskopie zur Untersuchung der Reorganisation des Actin-Systems an Substratkontakten motiler Zellen verwendet. Zellen, die fluoreszierende "Adhäsionsproteine" exprimieren, wurden mit hochauflösender Fluoreszensmikroskopie untersucht, chemisch fixiert und nach der Negativkontrastierung elektronenmikroskopisch dargestellt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das Lamellipodium eine Schlüsselrolle in der Etablierung von Substratkontakten einnimmt. Texte zur Publikation dieser Projekte sind in Arbeit.