Spezifische Inhibitoren der Protein Phosphatase 2A

Viele Publikationen über Proteinphosphatase 2A (PP2A) beginnen mit einem Satz wie diesem: "PP2A, eine sehr konservierte Serin/Threonin Phosphatase, ist an der Regulation vieler zellulärer Prozesse beteiligt". Die experimentellen Daten, die zu diesen Schlußfolgerungen führten, beruhen im wesentlichen auf der Verwendung von Inhibitoren, die mit ähnlicher Affinität an die katalytischen Untereinheiten von PP2A und PP2A- verwandten Phosphatasen binden und dadurch deren katalytische Funktion hemmen. Mit den heute verwendeten Substanzen ist es daher unmöglich, zwischen den intrazellulären Funktionen von PP2A und jenen von Proteinphosphatase 4 (PP4) und Proteinphosphatase 6 (PP6) zu unterscheiden. Darüberhinaus wird die Substratspezifität von PP2A durch die Interaktion der katalytischen mit weiteren, regulatorischen Untereinheiten bestimmt. Aus den verschiedenen regulatorischen Untereinheiten können über 70 verschiedene Holoenzyme zusammengesetzt werden. Die intrazelluläre Funktion der verschiedenen PP2A Enzyme ist jedoch größtenteils unbekannt, da spezifische Inhibitoren fehlen. Aus diesem Grund schlage ich vor, Inhibitoren zu entwickeln, die spezifisch an die regulatorische B oder B` Untereinheit von PP2A binden und die katalytische Aktivität der B- oder B`-Holoenzyme hemmen können. Zur Isolierung solcher Interaktoren/Inhibitoren werden wir eine kombinatorische Peptid-Aptamer Bibliothek mit Hilfe des "Two-Hybrid" Systems screenen. Peptid-Aptamere sind Antikörper-ähnliche Moleküle, die nach dem Zufallsprinzip zusammengesetzte Dodekapeptide an der Oberfläche eines Gerüstmoleküls wie z.B. des E. coli Thioredoxins präsentieren. Im Gegensatz zu anderen Selektionsmethoden wird der Screen der Aptamer Bibliothek in vivo, in der Hefe, durchgeführt. Aptamere, die auf diese Weise isoliert werden, erfüllen automatisch die Grundvoraussetzungen für eine intrazelluläre Anwendung: Sie sind nicht toxisch, werden stabil expremiert und sie interagieren mit dem Zielprotein auch in der reduzierenden, intrazellulären Umgebung. Ziel meines Projektes ist es, die im Two-Hybrid Screen isolierten Peptid-Aptamere hinsichtlich der Interaktion mit regulatorischen PP2A Untereinheiten, ihrer Interaktionsspezifität und der hemmenden Wirkung in vitro und in vivo zu charakterisieren. Die im Rahmen des Projektes entwickelten Inhibitoren werden es ermöglichen, die Beteiligung eines spezifischen PP2A Komplexes an der Regulation intrazellulärer Prozesse nachweisen und aufklären zu können. Das geplante Projekt wird somit einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis des multifunktionellen Enzyms PP2A liefern.

Proteinphosphatase 2A (PP2A) ist ein Paradebeispiel für die molekulare Architektur der Protein-Serin/Threonin Phosphatasen, die aus mehereren Untereinheiten aufgebaut sind. Enzyme wie PP2A bestehen in vivo aus einer katalytischen und einer von mehreren regulatorischen Untereinheiten, die für die Substratspezifität verantwortlich sind. Aus den uns bekannten PP2A Untereinheiten können kombinatorisch über 70 verschiedene PP2A Enzyme zusammengesetzt werden, jedes höchstwahrscheinlich mit eigener Substratspezifität. Die Funktion dieser verschiedenen PP2A Enzyme ist jedoch größtenteils noch unbekannt, da keine Inhibitoren existieren, die spezifisch nur ein bestimmtes PP2A Enzym hemmen. Mehrere Screens von Peptidaptamer-Bibliotheken nach solchen spezifischen PP2A Inhibitoren waren erfolglos. Deshalb konzentrierten wir unsere Anstrengungen darauf, zu verstehen wie der Aufbau der PP2A Enzyme in vivo reguliert ist, um zukünftig - basierend auf diesem Wissen - spezifische PP2A Inhibitoren entwickeln zu können. Wir analysierten die Biogenese dieser hochkonservierten Enzymfamilie im Modellorganismus Hefe. Im Rahmen des vorliegenden Projektes erhielten wir den Hinweis, dass die katalytische PP2A Untereinheit in einer Konformation mit niedriger Aktivität existieren kann, die einen Aktivator für den Wechsel in die aktive Konformation benötigt. Diese Voraussetzung deutete darauf hin, dass das gegenwärtige Modell der PP2A Biogenese unvollständig ist, da es nicht erklären kann, wie die unspezifische Phosphatase-Aktivität der katalytischen Untereinheit in Schach gehalten wird, bis der Komplexaufbau mit den für die Substratspezifität verantwortlichen Untereinheiten stattfindet. Wir konnten zeigen, dass die Aktivierung der katalytischen Untereinheit an den Aufbau des Holoenzyms gekoppelt ist und in Einklang mit diesem reguliert wird. Wir schlagen daher ein neuartiges Modell der PP2A Biogenese vor, in der eine straff regulierte Aktivierungskaskade Zellen vor der Gefahr von unspezifischen Dephosphorylierungen durch PP2A schützt. Darüberhinaus stellten wir im Rahmen des Projektes neue mono- und polyklonale Antikörper gegen PP2A Untereinheiten her, für deren Kommerzialisierung ich mit 2 Internationalen Biotool Firmen Lizenzverträge abschließen konnte. Das Projekt war daher nicht nur wissenschaftlich sondern auch in kommerzieller Hinsicht erfolgreich.