Kapillarelektrophorese v. zellulären endozyt. Kompartimenten

Membranumhüllte endozytische Kompartimente besitzen eine elektrisch geladene äussere Oberfläche die ihre Wanderung im elektrischen Feld ermöglicht. Diese Eigenschaft wird untersucht und zu deren Trennung und Charakterisierung mittels Kapillarelektrophorese (CE) verwendet werden. Um coated vesicles, frühe Endosomen, endosomale Transportvesikel, späte Endosomen, und Lysosomen zu verfolgen werden geeignete Fluoreszenzfarbstoffe und/oder rekombinante Markerproteine (fusioniert mit green fluorescent protein, oder mit dessen Derivaten, und exprimiert in transfizierten Zellen) verwendet werden. Die kinetische Evolution der verschiedenen Kompartimente wird ebenfalls mit Hilfe von pulse chase Experimenten unter Verwendung von konventionellen fluoreszierenden fluid phase Markern und gut bekannten endozytischen Markern wie dem Transferrin oder dem low-density Lipoprotein, deren Wege gut charakterisiert sind, verfolgt werden. Humane Rhinoviren (HRVs) sind kleine, RNA enthaltende lipidfreie Partikel, die die Hautpverursacher von Schnupfen darstellen. Sie dringen via Rezeptor vermittelter Endozytose in die Zelle ein, indem sie das interzelluläre Adhesionsprotein 1 (die grosse HRV Gruppe) und den low-density Lipoproteinreceptor (die kleine HRV Gruppe) verwenden. Eine Methode wird entwickelt werden, die es erlaubt, das Schicksal von Vertretern der beiden Rezeptorgruppen während ihres Infektionsweges zu verfolgen. Die Spur der Viren wird, angefangen von der Bindung an die Zellrezeptoren an der Plasmamembran durch die verschiedenen Kompartimente verfolgt werden. Zu diesem Zweck werden Methoden entwickelt werden, die es erlauben, das virale Kapsid und die virale genomische RNA separat entweder in vitro oder in vivo zu markieren. Die Analyte werden mittels CE getrennt und durch ihre verschiedenen spektralenEigenschaften identifiziert werden. Auf diese Weise wird das Schicksal der intakten Viren (nach der Aufnahme in die Zelle) und das der leeren Kapside und der RNA nach deren Freisetzung im Detail untersucht werden. Ko-lokalisation der Komponenten mit den endozytischen Markern wird es daher erlauben, jene vesikulären Kompartimente, in denen die RNA aus dem viralen Kapsid entlassen wird und Zugang zum Zytosol bekommt zu definieren. Die Kombination der hohen Auflösung der CE mit der hohen Selektivität und der Empfindlichkeit der Fluoreszenzdetektion wird es erlauben, die viralen Komponenten in den zellulären Kompartimenten während deren kinetischer Evolution zu verfolgen. Das Wissen um den detaillierten Mechanismus der Internalisation der Viren und um jenen Ort, an dem das Genom freigesetzt wird, ist essentiell für die Entwicklung neuer antiviraler Strategien.

Das Verständnis der einzelnen Stufen des Infektionswegs von Viren in die Wirtszelle ist von Bedeutung für der Entwicklung rationaler antiviraler Strategien. Humane Rhinoviren (HRVs) sind kleine, RNA enthaltende lipidfreie Partikel, die die Hauptverursacher von Schnupfen darstellen. Sie dringen via Rezeptor-vermittelter Endozytose in die Zelle ein. Die äußere Hülle der Viren besteht aus Proteinen, und ist deshalb unter geeigneten Bedingungen elektrisch geladen. Deshalb können die Virusteilchen, aber auch ihre Zerfalls- und Reaktionsprodukte, in einem elektrischen Feld getrennt werden. Dies erfolgt in der Kapillarelektrophorese in einer wässrigen Lösung in engen Kapillaren, an welche eine Hochspannung angelegt wird. Die Virusproben werden an einem Ende in einer schmalen Zone eingebracht, wandern elektrophoretisch unter dem Einfluß des elektrischen Feldes, und können am anderen Ende durch Fluoreszenz detektiert werden, welche mittels eines Laser-Strahls angeregt wird. Vorbedingung dieser Methode ist aber, daß die viralen Bestandteile (genomische RNA und Hüllproteine) mit entsprechenden Fluoreszenz-Farbstoffen markiert werden. In diesem Projekt gelang diese Markierung mit unterschiedlichen Farbstoffen, wodurch diese beiden Kompartimente sowohl im intakten Virus als nach seinem induzierten Zerfall bestimmt werden konnten. Mit dieser Methode gelang es auch, die Interaktion der markierten Viren mit Zellrezeptoren zu monitoren, sowie das Anbinden von Virusteilchen an künstliche Zellmembranen zu untersuchen. Damit können die ersten Schritte der Endozytose an definierten Modellsystemen untersucht werden.