Genexpression in der Differenzierung von Physarum

Physarum polycephalum, ein als Plasmodium wachsender Schleimpilz, ist ein gut etabliertes Modellsystem zum Studium von Zellzyklus- und Differenzierungsvorgängen. In früheren Arbeiten charakterisierten wir Stickstoffmonoxid Synthase (NOS) und Pteridin Stoffwechsel dieses Organismus. Wir konnten zeigen, dass die Limitierung von Glucose, eine Voraus-setzung zur Erlangung der Fähigkeit zu sporulieren , NOS stark induziert. Wir identifizierten NO und cGMP als wesentliche Signalmoleküle bei der licht-induzierten Ausbildung reifer Fruchtkörper (Sporangien) und zeigten, dass die Expression von lig1, einem frühen sporulationsspezifischen Gen, das zum Zellzyklus- und DNA-Schaden-Erkennungsgen hus1 aus Hefe und Säugetieren homolog ist, positiv mit der Expression von NOS und der Fähigkeit zu sporulieren korreliert. Im angesuchten Projekt planen wir nun, die Zielmoleküle für das NO/cGMP Signal während der Sporulation sowie jene Signale, die NOS als Antwort auf Glucose-Aushungerung induzieren, zu identifizieren. Weiters sollen die Genstrukturen, Promotoren, sowie Signale, die die Promotoraktivität und somit die Expression der beiden in Physarum identifizierten NOS Gene physnosa und physnosb regeln, untersucht werden. Dazu sollen Physarum Stämme mit veränderter NOS Expression (knock-out und Überexpression), biochemische Hemmung der Enzyme, die in der NO/cGMP Signalkaskade involviert sind und eine bereits etablierte sporulationsdefiziente Physarum Mutante verwendet werden. Verschiedene Polymerasekettenreaktions (PCR) Techniken und zweidimensionale Protein Gelelektrophorese (Proteomanalyse) werden zur Erstellung differentiell exprimierter Gen- und Proteinprofile unter verschiedenen Bedingungen eingesetzt. Identifizierte Zielgene- bzw. proteine werden rekombinant exprimiert und weiter charakterisiert. Genomstrukturen und Promotoren werden mittels PCR Techniken studiert. Promotoraktivität auf verschiedene Signale wird mit Hilfe von Reportergen-Analysen und Gel Shift Assays untersucht. In tierischen Organismen sind eine Vielzahl von biologischen Effekten von NO gut charak-terisiert. Trotzdem sind in den sehr gut untersuchten Säugetierspezies jene Gene, die während der Zelldifferenzierung durch NO/cGMP beeinflusst werden, nicht im Detail bekannt. Diese Zusammenhänge in Physarum zu studieren sollte es erlauben noch nicht verstandene Signalwege, die auch in komplexeren biologischen Systemen wie etwa Tieren von Bedeutung sein könnten, zu identifizieren und damit ein besseres generelles Verständnis der komplexen Signalwege, die die Zelldifferenzierung kontrollieren, zu erlangen.

In früheren Arbeiten konnten wir zeigen, dass die Sporulationsfähigkeit von Physarum im direkten Zusammenhang mit der Induktion des Enzyms Stickstoffmonoxydsynthase (NOS) steht. Im Verlauf des vorliegenden Projektes konnten wir zwei verantwortliche Gene für die Codierung der NOS charakterisieren und ihre Genstruktur aufklären. Die entsprechenden Proteine wurden in E.coli überexprimiert, biochemisch charakterisiert und die, für die Aktivität erforderliche N-terminale Sequenz identifiziert. Weiters wurden NOS-Knock-out Plasmide hergestellt und eine Methode zur Transformation von Physarum-Amöben entwickelt, mit dem Ziel Physarum NOS-Knock-out Stämme herzustellen. Stichstoffmonoxyd (NO) wirkt in vielen Organismen auf das Enzym Guanylat- Zyklase. Wir untersuchten dieses Enzym und dessen Abhängigkeit von NO in einem Wildtyp- und einem Sporulations-defizienten Physarum- Stamm. Ein Schwerpunkt der Arbeiten waren die differenziellen Proteomstudien im Verlauf der Sporulation. Eine neue Methode zur Messung von Änderungen der Proteinexpression, die "Zwei dimensionale Differentielle Gel Elektrophorese" (DIGE) wurde zur Analyse der Proteinexpression im Verlauf der Sporulation verwendet. Die Proteinexpression im Verlauf der fünftägigen Hungerphase und der Einfluss des Lichtimpulses wurde in einem Wildtyp- und einem Sporulations-defizienten Stamm untersucht. Die Analyse der differentiell exprimierten Proteine und deren Identifikation wird zur Zeit durchgeführt. In Zusammenarbeit mit Wolfgang Marwan vom Max Planck Institut für Dynamik komplexer technischer Systeme in Magdeburg und mit Gernot Glöckner vom Institut für Molekulare Biotechnologie in Jena wurde ein Transcriptom Sequenzierungsprojekt begonnen, in der Zwischenzeit sind bereits mehr als 5000 unterschiedliche cDNA Sequenzen aus Physarumkulturen zu verschiedenen Zeitpunkten der Sporulation isoliert worden. Das Erstellen einer Datenbank mit dem Physarum Transkriptom ist für die Identifizierung der Proteine die aus den differentiellen Expressionsversuchen isoliert wurden erforderlich. Ein von uns iniziertes Meeting von internationalen Physarum Experten in Innsbruck im Juli 2004 war der Startpunkt für des Physarum Genom Projekt am NIH (http://www.genome.gov/12511858) Die Physarum- Sequenzierung wird am Genom Sequencing Center der Washington University in St.Louis, USA durchgeführt. Der Vorgang der Differenzierung und dessen Regulation ist eine der wichtigsten Fragen in der Zellbiologie. So gibt es z.B. neue Theorien zur Tumorentwicklung, die enge Zusammenhänge zwischen Tumorentwicklung und Defekte in der Steuerung der Differenzierung herstellen. Das Verständnis der Regulation zwischen Proliferation und Differenzierung einer Zelle ist deshalb von grosser Bedeutung. Physarum hat viele Eigenschaften die ihn zu einem geeigneten Modellorganismus machen, an dem diese Vorgänge untersucht werden können.