Proteom-Analyse von Peroxisomen

Peroxisomen sind Organellen die lebenswichtige Stoffwechselvorgänge katalysieren. Funktionsstörungen der Peroxisomen führen zu einer Reihe von schweren Erkrankungen, zumeist mit neurologischen Symptomen. In diesem Projekt soll die Proteinzusammensetzung der Peroxisomen aus verschiedenen Zelltypen und Geweben mittels Proteom-Analysen untersucht werden. Dazu soll zuerst eine transgene Maus erzeugt werden, die unter Kontrolle des Ubiquitin-C Promotors ein Fusionsprotein bestehend aus einem verkürzten Peroxin-3 (pex3) und dem Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) produziert, das dann in den Peroxisomen aller Zellen enthalten ist und zur Autofluoreszenz dieses Organells führt. Aus Geweben dieser transgenen Mäuse sollen durch Affinitätschromatographie mit antikörperbeschichteten Magnetpartikeln (Dynabeads) Peroxisomen isoliert werden. Die peroxisomalen Proteine werden anschließend mittels hochauflösender, 2D-Gelelektrophorese (2D-PAGE) aufgetrennt und durch Massenspektroskopie (MALDI-TOF MS, nano-ESI MS) oder Mikrosequenzierung identifiziert. So soll zuerst ein Katalog aller Peroxisomenproteine aus Leber erstellt werden, weil sie diesbezüglich zur Zeit das bestcharakterisierte Organ ist. Der nächste Schritt ist die Analyse der Peroxisomen aus Gesamthirn sowie aus primären Zellkulturen von Neuronen, Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten. Dazu werden - wie oben beschriebenen - Peroxisomen isoliert, die Proteine durch 2D-PAGE aufgetrennt und das Expressionsmuster mit dem der Leber verglichen. Es wird nicht nur möglich sein, neue Proteine oder neue Proteinisoformen zu detektieren, sondern auch Proteine zu finden, deren peroxisomale Lokalisation bisher nicht bekannt war. So könnten neue biochemische Funktionen den Peroxisomen zugewiesen werden.

Peroxisomen sind lebensnotwendige von einer Membran umschlossene Organellen. Jede Zelle, die einen Zellkern besitzt hat auch Peroxisomen. Eine Fülle von biochemischen Reaktionen werden entweder zur Gänze oder teilweise in Peroxisomen durchgeführt. Unter anderem sind die Peroxisomen an der Synthese von einigen Fettsäuren, den Plasmalogenen sowie der Gallensäure beteiligt. Genetisch bedingte Störungen in peroxisomalen Proteinen führen zu einer Reihe von schweren, oft tödlich verlaufenden Erkrankungen wie zum Beispiel dem Zellweger Syndrom und der X-chromosomale Adrenoleukodystrophie. Hinweise auf die Beteiligung peroxisomaler Funktionen bei häufigen Erkrankungen wie bei der Tumorentstehung oder bei Morbus Alzheimer unterstreichen zusätzlich die Bedeutung dieser Organellen. Um die Peroxisomen besser untersuchen zu können, haben wir in Kooperation mit Klaus-Armin Nave vom Max Planck Institut für experimentelle Medizin, Göttingen eine gentechnisch veränderte Maus entwickelt, in der alle Peroxisomen grün fluoreszieren. Mit diesem Peroxisomen Mausmodell sind wir in der Lage, die intrazellulären dynamischen Bewegungen der Peroxiosmen in lebenden Zellen zu untersuchen. Da sich der fluoreszierende Peroxisomale-Anker an der äußeren Seite der Peroxisomalen-Membran befindet, können wir dieses Mausmodel zur Isolierung von hochreinen Peroxisomen für fortgeschrittene Proteom-Analysen verwenden. Parallel zu diesen Untersuchungen haben wir Peroxisomen aus Mäuseleber und -niere mit Hilfe konventioneller Reinigungsverfahren isoliert und die Protein-Zusammensetzung in Zusammenarbeit mit Helmut E. Meyer und Bettina Warscheid vom Medizinischen Proteom-Center der Ruhr-Universität Bochum untersucht. Mit diesem Ansatz konnten wir 120 peroxisomale Proteine und deren Variationen identifizieren. Interessanterweise konnten wir klare Unterschiede zwischen der Protein-Zusammensetzung der Peroxisomen aus Leber und Niere feststellen. Diese Untersuchungen liefern zusätzliche Beweise dafür, dass unterschiedliche biochemische Prozesse in Peroxisomen der Leber und der Niere stattfinden. Zudem ist es uns gelungen, mit Hilfe dieses Ansatzes ein neues peroxisomales Protein zu identifizieren, das wir gerade weiter charakterisieren.