Charakterisierung eines neuen E2F bindenden Proteins

Die Expression vieler Gene deren Produkte für den Ablauf des Zellzyklus in Säugerzellen bedeutsam sind, wird durch Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie kontrolliert. Durch ihre Wechselwirkung mit wichtigen Wachstums- und Zellzyklusregulatoren wie pRB dem Produkt des Retinoblastom-Tumor-Suppressor-Gens, Cyclinen und cyclinabhängigen Kinasen (cdk`s) bilden sie ein wichtiges Bindeglied zwischen Zellzykluskontrolle und Transkription. Die Aktivität der E2F Faktoren wird durch eine Vielzahl von Mechanismen kontrolliert wobei Interaktionen mit Zellzyklusregulatoren wie pRB oder mit anderen Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle spielen. Die Amino-terminale Teil von E2F1 enthält mehrere Proteinbindungsstellen die für die Regulation dieses Transkriptionsfaktors bedeutsam sind. So führt die Bindung eines Cyclin A/cdk2 Komplexes zur Phosphorylierung des Faktors und in weiterer Folge zu einer Verminderung der DNA Bindung. Die Bindung von p45(SKP2) hat die Ubiquitinierung und damit verbunden den Abbau von E2F1 zur Folge. Für die Aktivierung bestimmter Promotoren scheint wiederum die Interaktion mit Transkriptionsfaktoren der Sp1 Familie eine wichtige Rolle zu spielen. Um weitere Proteine zu identifizieren, die mit E2F1 interagieren führten wir einen sogenannten "Two Hybrid Screen" in Hefe durch. Dabei konnten wir ein bisher nicht charakterisiertes Protein identifizieren. Dieses Protein liegt in stark phosphorylierter Form vor und wird daher von uns als EAPP (E2F Associated PhosphoProtein) bezeichnet. Die Expression dieses Gens scheint wachstumsreguliert zu sein. Immunfluoreszenzexperimente zeigten, daß EAPP wie E2F1 im Kern lokalisiert ist. Die Coexpression von EAPP mit E2F1 führte zu einer starken Aktivierung eines E2F abhängigen Promotors. Dies bedeutet, daß EAPP eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der E2F abhängigen Transkription spielen könnte. Ziel dieses Projekts ist die genaue Erforschung der Funktion von EAPP sowie der Interaktion von EAPP mit E2F1 und möglicherweise auch anderer E2F Proteine. Die E2F stimulierende Aktivität von EAPP wird mit Hilfe von Reporterassays sowohl mit E2F abhängigen als auch E2F unabhängigen Promotoren untersucht werden. Durch Fraktionierung und anschließende Analyse von Zellextrakten sollen Proteinkomplexe identifiziert werden welche sowohl E2F1 als auch EAPP enthalten.

Ziel dieses Projekts war die Erforschung der Funktion von EAPP sowie der Interaktion von EAPP mit E2F-1 und anderer E2F Proteine. EAPP wurde in meinem Labor als E2F bindender Faktor identifiziert. Die Expression vieler Gene deren Produkte für den Ablauf des Zellzyklus in Säugerzellen bedeutsam sind, wird durch Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie kontrolliert. Wir konnten zeigen, daß EAPP mit den aktivierenden E2Fs, E2F-1, -2, and -3, aber nicht mit dem Repressor E2F-4 interagiert. Um die Expression, die intrazelluläre Lokalisation und die Eigenschaften von EAPP zu untersuchen stellten wir sowohl poly- als auch monoklonale Antikörper gegen EAPP her. Es zeigte sich, daß EAPP im Zellkern lokalisiert ist und ein eigenes Kernlokalisationssignal besitzt welches wir durch Deletionsanalyse den Aminosäuren 121-135 zuordnen konnten. Während des größten Teils des Zellzyklus bleiben die EAPP Mengen ziemlich konstant, das Protein verschwindet jedoch mit dem Beginn der Mitose. Längerer Entzug von Serum und damit von Wachstumsfaktoren führte ebenfalls zu einer Verringerung von EAPP. Die Untersuchung menschlicher mRNA zeigte, daß EAPP in einer Vielzahl von Geweben expremiert wird. Reportergenassays zeigten, daß EAPP die Expression von E2F kontrollierten, zellzyklusabhängigen Genen verstärken kann. Überraschenderweise wurde jedoch die Aktivität des Promotors des Tumorsuppressors p14ARF der ebenfalls durch E2F-1 aktiviert wird, durch EAPP gehemmt. p14ARF kann Apoptose, den programmierten Zelltod, gemeinsam mit p53 aber auch unabhängig davon induzieren. Die Unterdrückung der p14ARF Expression durch EAPP könnte Zellen mit abweichendem Wachtstumsverhalten vor der Apoptose bewahren und damit zur malignen Transformation von Zellen beitragen. Das bedeuted aber auch daß EAPP ein Protoonkogen sein könnte. Damit übereinstimmend stellten wir fest, daß fast alle untersuchten menschlichen Krebzellen erhöhte EAPP-Mengen aufweisen. Außerdem konnten wir zeigen daß die Überexpression von EAPP wachstumsbeschleunigend, die Reduktion von EAPP hingegen wachstumshemmend wirken. Zusammenfassend kann daher gesagt werden, daß EAPP die E2F abhängige Transkription beeinflußt, wachstumsstimulierend wirkt und bei der Krebsentstehung eine Rolle spielen könnte.