Stomatin in Lipid Rafts

Stomatin wurde ursprünglich als ein Hauptprotein der Erythrocytenmembran beschrieben, findet sich aber praktisch in allen humanen Geweben. Da es in verschiedenen Zellen mit sekretorischen Vesikeln, aber auch Phagosomen und Endosomen assoziiert vorkommt, nehmen wir an, dass es für die Funktion dieser Vesikel essentiell ist. Es gibt Patienten mit einer erblichen Anämie-Form (Overhydrated Hereditary Stomatocytosis, OHSt), deren Erythrocyten kein Stomatin enthalten und einen gestörten K+ /Na + -Haushalt aufweisen. Daher wurde postuliert, daß Stomatin ein Regulator eines K+ /Na + -Kanals wäre. Unsere Daten weisen jedoch auf eine Rolle als membrangebundenes, oligomeres Strukturprotein hin, das mit Cholesterin- und Sphingolipid-reichen Membrandomänen (Lipid Rafts) assoziiert ist. Die Klassifizierung als Lipid Raft-Protein impliziert eine wichtige Rolle für Stomatin als Komponente bei der Signaltransduktion. Im Projekt "Stomatin in Lipid Rafts" soll die Bedeutung von Stomatin als Lipid Raft-Komponente genauer untersucht werden. Dazu verwenden wir biochemische, biophysikalische, molekularbiologische und zellbiologische Methoden. Unsere vorläufigen Daten deuten darauf hin, dass es viele verschiedene, spezifische Raft-Strukturen gibt, die nebeneinander bestehen, wobei die Stomatin-spezifischen Rafts erst wenig untersucht wurden. In diesem Projekt sollen daher die grundlegenden Eigenschaften dieser Stomatin-Rafts bestimmt werden, nämlich ihre Synthese, Zusammensetzung, Stabilität und Rolle bei Signaltransduktionen. Wichtige Fragen betreffen auch die Wechselwirkungen von Stomatin mit anderen Raft-Proteinen, -Lipiden und Cytoskelett-Komponenten, sowie die Vorbedingungen für die Bildung und Organisation dieser Stomatin-Rafts, das sind in erster Linie die Regulation der Oligomerisierung und der Modifizierung von Stomatin durch Palmitoylierung und Phosphorylierung. Als medizinisch relevantes Thema wird im Rahmen des Projektes auch ein möglicher Kandidat für die Stomatocytose (OHSt) diskutiert.

Im Projekt P15486 "Stomatin in Lipid Rafts" wurden einige wichtige Aspekte des Membranproteins Stomatin im Zusammenhang mit den Cholesterin- und Sphingolipid-reichen Membrandomänen (Lipid Rafts) untersucht. Da Stomatin ein Hauptprotein der Erythrocyten Lipid Rafts ist, haben wir diese eingehend analysiert und fanden dabei eine Verknüpfung der Rafts mit dem Cytoskelett. Unsere Experimente zeigten, dass die Bindung des Cytoskeletts an die Lipid Rafts vom Cholesterin-Gehalt der Zellmembran abhängt. Einige Ergebnisse von verschiedenen Blutproben haben darauf hingewiesen, dass diese Abhängigkeit auch im lebenden Organismus besteht, allerdings muss das noch durch eine umfangreichere Studie von Blutproben mit unterschiedlichen Cholesterinwerten (Patientenblut) belegt werden. In einer anderen Studie untersuchten wir die Anreicherung von Stomatin in Membranvesikeln, die unter verschiedenen Bedingungen, wie erhöhter Calcium-Spiegel in der Zelle, Alterung der Erythrocyten im Kreislauf und Lagerung von Blutkonserven entstehen und abgegeben werden. Der Mechanismus dieser Anreicherung ist nicht bekannt, er könnte aber mit der besonderen Struktur des Stomatin-Moleküls und der Fähigkeit zur Ausbildung hochmolekularer Komplexe (Oligomere) zusammenhängen. Wir haben Stomatin auch in anderen Zelltypen untersucht, wie Thrombocyten, neutrophile Granulocyten und Epithelzellen. Interessant ist dabei, dass es dort nicht so sehr an der Zellmembran vorkommt, sondern an der Membran von inneren Vesikeln. Diese enthalten ebenfalls Lipid Rafts. Bei der Untersuchung eines markierten Stomatins in lebenden Epithelzellen fanden wir auch eine Anreicherung an der Oberfläche von Lipidtröpfchen. Mit Hilfe einer hochempfindlichen Videomikroskopie in Kooperation mit der Univ. Linz konnten wir vielfache Wechselwirkungen von Stomatin-positiven internen Vesikeln mit den Stomatin-positiven Lipidtröpfchen beobachten, sodass eine Funktion für das Stomatin beim Lipidtransport und/oder bei der Regulation des Metabolismus möglich erscheint. Die proteomische Analyse der Lipidtröpfchen in Zellen mit oder ohne Stomatin zeigte keine gravierenden Unterschiede, jedoch war das Ergebnis selbst sehr überraschend und ließ den Schluss zu, dass die Lipidtröpfchen nicht einfach Lipidspeicher sind, sondern aktiv in den Stoffwechsel eingreifen. In einer umfassenden Mutationsanalyse von Stomatin haben wir eine Domäne identifiziert, die für die Ausbildung von Oligomeren notwendig ist. Innerhalb dieser befinden sich 3 Aminosäuren, die für die Lipid Raft-Assoziation verantwortlich sind. Da einige Mutanten keine Oligomere bilden konnten, aber mit Lipid Rafts verknüpft waren, schließen wir daraus, dass die Oligomerisierung nicht für die Lipid Raft-Assoziation erforderlich ist. Eine Mutante, die weder Oligomere bilden, noch mit Lipid Rafts assoziieren konnte, wurde nichtsdestoweniger an der apikalen Seite von Epithelzellen exprimiert. Es ist noch unklar, welches Signal für den apikalen Transport verantwortlich ist, jedoch ist es weder die Oligomerisierung, noch die Lipid Raft Assoziation, zwei Bedingungen, die früher als wichtig für die apikale Sortierung angesehen wurden.