Entwicklung von Arginin selektiven Analysemethoden

Proteine und Peptide, die in iher Aminosäuresequenz zwei oder mehrere benachbarte Argininreste (Arg) enthalten, können durch einen besonders aktiv unterstützenden Transportmechanismus (twin-arginine transloctation, Tat pathway) durch die Zellmembran in die Zelle gelangen. Ein wichtiges Beispiel für diesen Effekt ist korreliert mit der benötigten Vervielfältigung eines Proteins des HIV Virus. Es konnte zudem gezeigt werden, daß dieser Mechanismus generell zu sein scheint, das heißt daß Peptidsequenzen mit mehreren benachbarten Argininresten, welche gegebenenfalls auch an nicht peptidische Wirkstoffe geknüpft sind, mit hoher Effizienz durch die Zellmembran in die Zelle, d. h. an den eigentlichen Wirkort, transportiert werden können. Damit eröffnet sich ein weites Feld für neue Wirkstoffforschung unter Einbeziehung von effizienten Transport- und Bioverfügbarkeitskriterien. Basierend auf der potentiell großen Bedeutung dieser Arg-Gruppen in Proteinen und Peptiden, bzw. der Guanidin-Gruppe in peptidomimetischen Verbindungen, definiert sich als Ziel des gegenständlichen Projektes analytische Methoden bereitzustellen, die die selektive Anreicherung, Abtrennung, Identifizierung und Quantifizierung dieser bioaktiven Substanzen mittels flüssig-chromatographischer und massenspektrometrischer Techniken erlauben. Die formulierten analytischen Konzepte, welche auf mehrdimensional aufgebauten Molekülerkennungs- bzw. Trennkriterien fußen, ermöglichen eine gezielte Vereinfachung der sehr komplex zusammengesetzten Probenmatrix (Protein- bzw. Peptid-Gemische vor und nach einem z.B. tryptischen Verdau), was entscheidend ist um Moleküle auch in sehr gringen Konzentrationen zweifelsfrei zu identifizieren. Damit sollte ein interessanter Beitrag auf dem Gebiet der Analytik in den Life Sciences gelingen, welcher in dieser Konzeption neuartig ist. Die hohe Gruppen- und/oder Substanzselektivität der zu entwickelnden Methoden beruht auf dem Konzept der molekularen Erkennung der Argininreste durch geeignete komplementäre Selektormoleküle bzw. Liganden, die in einem Falle als Additive in der Massenspektrometrie zum Einsatz kommen, um dieserart eine hochselektive Erkennung der Vebindungen zu ermöglichen. Auf ähnlichem Prinzip aufbauend werden parallel dazu Polymermaterialien als hochselektive chromatographische Phasen entwickelt, welche eine effektive Abtrennung unerwünschter Analyte aus einer komplexen Mischung bzw. eine gezielte Anreicherung der Arginin-hältigen Zielkomponenten ermöglichen. Ein wesentlicher Fokus all der geplanten Methoden liegt auf der Etablierung von quantitativen LC-MS/MS Methoden basierend auf den oben erwähnten Arginin-Affinitätsprinzipien, um damit auch die Auf- und Abregulierung von biologisch wichtigen Leitverbindungen erfassen zu können. Hierzu ist Synthese und Einsatz von kalten isotopenmarkierten Reagenzien im Zusammenhang mit MS/MS Detektion geplant.

Die Zielsetzung des FWF Projektes mit dem Titel "Entwicklung von Arginin selektiven Analysenmethoden" orientiert sind an der Erforschung von molekularen Erkennungs- und Wechselwirkungsmechanismen von Molekülen am Beispiel der stark basischen Guanidin Gruppe in der Seitenkette der Aminosäure Arginin, welche in Peptiden und Proteinen eingebaut ist, mit chemoselektiven und/oder sauren Reaktionspartnern. Dieserart können entweder chemoselektiv kovalent gebundene Reaktionsprodukte entstehen oder nicht-kovalent gebundene Komplexe oder Assoziate über intermolekular wirkende Wechselwirkungskräfte. Schwerpunktsmäßig wurden drei Forschungsrichtungen verfolgt: (a) Die chemoselektive pH-kontrollierte quantitative Derivatisierung der Guanidin Gruppe mit 2,3-Butandion (BD) und Phenylboronsäure (PBA) für eine verbesserte massenspektrometrische Analytik von Arginin-haltigen Peptiden und Proteinen. (b) Parallel dazu gelang es einen chemoselektiven Sorptionsprozess zu entwickeln, unter Zuziehung von Phenylboronsäure enthaltenden Materialien mit deren Hilfe nun selektiv Arginin-hältige Peptide aus einem komplexen Gemisch von Peptiden, wie z.B. aus einem Verdau von Proteinen, von anderen Peptiden abgetrennt und angereichert werden konnten, was zu einer wesentlichen Vereinfachung der Peptid- und Protein-Analytik führt. (c) Als weiteren Meilenstein sehen wir die Etablierung von schnellen ESI-MS/MS Verfahren zum Studium von Molekülassoziaten von Arg-hältigen Verbindungen mit verschiedenen Säuren in wässriger Lösung. Dieserart erhielt man wertvolle Information im Bezug auf qualitative und quantitative Struktur-Wechselwirkungsbeziehungen, welche für die Weiterentwicklung neuer Materialien und Methoden in der Bioanalytik wichtig sind.