FRET-Studien über Protein-Protein Wechselwirkungen in vivo

Forschungsprojekt P 14653FRET-Studien über Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivoHelmut RUIS09.10.2000 Eine große Zahl von Signaltransduktionswegen haben bei der Regulation des Wachstums, der Teilung und des Überlebens eukaryotischer Zellen zentrale Bedeutung. In diesem Zusammenhang spielt die spezifische Wechselwirkung zwischen verschiedenen Signalproteinen eine überragende Rolle. Diese Art von Wechselwirkungen direkt in lebenden Zellen zu verfolgen ist daher eines der wichtigster. Anliegen der molekularen Zellbiologie. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zwischer Proteinen, welche mit geeigneten Mutantenderivaten (CFP und YFP) des bakteriellen Greer Fluorescent Protein (GFP) fusioniert wurden, ermöglicht es, solche Wechselwirkungen in lebender Zellen mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie zu verfolgen. Die praktische Realisierbarkeit diesei Strategie im Modellorganismus Saecharomyces cerevisiae wurde von einer anderen Forschungsgruppe vor kurzem gezeigt. Unsere Forschungsgruppe hat in den letzten Jahren Signaltransduktionsprozesse und in dieserr Zusammenhang insbesondere auch die dynamische zelluläre Lokalisation verschiedener Signalproteinc (Proteinkinase A (PKA), Hogl MAP-Kinase, die Transkriptionsfaktoren Msn2 und Msn4) im Rahmer der generellen Stressantwort der Sprosshefe studiert. Wir wollen versuchen, in Zukunft mit Hilfe dei FRET-Methodik eine neue Ebene des mechanistischen Verständnisses dieser Prozesse zu erreichen Wir wollen in diesem Zusammenhang Schlüsselwechselwirkungen zwischen Proteinen in lebender. Zellen nachweisen, lokalisieren und kinetisch verfolgen. Im Rahmen des hier vorgelegten Projekts wollen wir folgende Wechselwirkungen studieren: (1) Zwischen der regulatorischen PKA-Untereinheit Bcyl und dem Zdsl-Protein; dieses hal möglicherweise eine Funktion als ein Hefe-Analoges von A-Kinase-Ankerproteinen (AKAPs) höherei Eukaryoten. (2) Die in vivo-Wechselwirkungen von Zds 1 mit anderen Proteirien; Zds.1 , ist. offenbar eir. multifarik tioneIles Protein --der SprOsshefe. Wir nehmen als Arbeitshypothese an, dass dies mechanistisch unter anderem darauf beruht, dass ~ es ähnlich wie Säu getier-AKAPs eine multivalentE Plattform zur räumlichen Organisation einer Reihe von Signaltransduktionsfaktoren darstellt. Wij wollen die Richtigkeit dieser Hypothese untersuchen und das System näher studieren. (3) Die Wechselwirkung zwischen den Transkriptionsfaktoren Msn2 und Msn4 mit den 3 PKA Isoenzyrnen`Tpkl, Tpk2 und Tpk3 * Unsere, bisherigen Untersuchungen sprechen. dafür, dass, irr. Rahmen der negativen Regulation der generellen Stressantwort Msn2 und Msn4 durch PK phoSPhoryliert werden. Besonders sind wir in diesem Zusammenhang darän~interessiert, die zellulärt Lokalisation solcher Wechselwirkungen abzuklären und festzustellen, ob letztere durch Stressfaktorer abgeschwächt werden. Mns2/4 werden durch Stressfaktoren möglicherweise dadurch aktiviert, das diese den negativen Msn2/4-Regulator PKA hemmen. (4) Alternativ könnten Stress-Signale Msn2 und Msn4 dadurch regulieren, dass si( Phosphoproteinphosphatasen, welche diese Transkriptionsfaktoren dephosphorylieren, aktivieren. Wi wollen solche Msn2-Phosphatasen durch FRET-Analyse identifizieren und untersuchen, ob derer Wechselwirkung mit Msn2 durch Stress reguliert wird. (5) Die in diesem Zusammenhang hergestellten Mutanten-GFP-Phosphatase-Fusionskonstrukte soller in Zukunft, im wesentlichen im Rahmen eines Folgeprojekts, verwendet werden, urr Interaktionspartner von Hefe- Proteinphosphatasen systematisch zu studieren. Wir wollen diese Studi im Rahmen des hier vorgelegten Projekts damit beginnen, dass wir die zur Zeit noch hypothetisch Wechselwirkung zwischen der Phosphatase Calcineurin und dem Zdsl-Protein nachweisen und nähe untersuchen. Während in Hefe für diese Wechselwirkung genetische Evidenz existiert, wurde ein möglicherweise funktionell analoge Wechselwirkung zwischen Calcineurin und dem Säugetier AKAP79 direkt nachgewiesen. Letztere Wechselwirkung scheint ein Teilaspekt der Funktion vor AKAPs als Signaltransduktions-Plattformen zu sein (siehe unter (2. Wir hoffen, durch unsere Studier Evidenz für eine ähnliche Funktion des Zdsl-Proteins von Sprosshefe zu erhalten. n.

Die reversible Modifikation von Proteinen stellt einen fundamentalen Mechanismus zur Regulation zellulärer Prozesse dar. Unsere Arbeitsgruppe hat über mehrere Jahre versucht dynamische und mechanistische Aspekte von Proteinphosphorylierung und Dephosphorylierung an einem Modellsystem in der Bäckerhefe im Detail zu studieren. Im speziellen wurde ein Transkriptionsfaktor namens Msn2 analysiert, der die transkriptionelle Reprogrammierung im Zuge akuter Stresssituationen vermittelt. Unter optimalen Wachstumsbedingungen verbleibt dieser Faktor hauptsächlich im Zytoplasma beziehungsweise inaktiv. Diese Herabsetzung der Msn2 Funktion wird durch hohe Aktivitäten von cAMP abhängiger Proteinkinase (kurz PKA) verursacht. PKA ist ein wichtiger Signalträger für verschiedene Wachstumsprozesse in Hefe. Wie wir zeigen konnten phosphoryliert PKA Msn2 direkt und die entsprechenden Modifikationen scheinen einen wesentlichen Einfluss auf die intrazelluläre Verteilung von Msn2 auszuüben. Stress und Hungerbedingungen schwächen diese Effekte der PKA Aktivität deutlich ab. Überaschenderweise zeigten biochemische Studien, dass negative Umweltbedingungen aber ihren Einfluss nicht über den Phosphorylierungsgrad des Transkriptionsfaktors vermitteln. Eine wichtige Ausnahme stellt in diesem Bezug jedoch der Entzug von Glukose dar. In diesem Fall konnte eine vorübergehende Abnahme an allen PKA abhängigen Modifikationen dokumentiert werden. Proteinphosphatasekomplexe, die diese Phosphorylierung an Msn2 entfernen, wurden von uns als Verwandte der Proteinphosphatase I (PP1) identifiziert. Weiters ergab sich, dass diese Komplexe den Transkriptionsfaktor sowohl direkt wie indirekt beeinflussen, was eine detaillierte Analyse des Systems etwas erschwerte. In Kombination mit einem noch unbekannten Regulator wird Msn2 direkt beeinflusst. In Zusammenhang mit Reg1, eine der klassischen PP1 regulatorischen Untereinheiten, wird durch die Phosphatase verhindert dass ein zweites mit PKA nicht verwandtes Modifikationssystem Msn2 an entsprechenden PKA Erkennungsmotiven phosphoryliert. In unseren Studien wurde versucht die entsprechenden Interaktionen von Msn2 und seinen regulatorischen Faktoren nicht nur über biochemische und genetische Ansätze zu analysieren sondern auch über neuere zellbiologische Methoden. Obwohl in höheren Eukaryoten exzellente Resultate mit Fluoreszenzresonanzmethoden (z. B. FRET mit fluoreszierenden Proteinfusionen) auf dem Gebiete von Signaltransduktionskomplexen erzielt worden sind, scheinen die entsprechenden methodischen Ansätze in der Hefe keine brauchbaren Ergebnisse liefern zu können.