Strukturelle und funktionelle Analyse von Pectin

Forschungsprojekt P 14520Strukturelle und funktionelle Analyse von PlectinGerhard WICHE26.06.2000 Plectin ist ein in verschiedenen Geweben und Zelltypen weit verbreitetes Protein riesiger Grösse, das alle Eigenschaften eines multifunktionellen cytoskelettären Vernetzungsproteins aufweist. Es besitzt Multidomänenstruktur und weist vielseitige Bindungsaktivitäten auf. Seine subzelluläre Verteilung deutet auf eine Rolle als Stützelement der Zelle gegen mechanische Belastungen hin. Erbliche Defekte im Plectingen verursachen Epidermolysis bullosa simplex (EBS-MB), eine schwere menschliche Erkrankung, die mit Hautablösung, muskulärer Dystrophie und Neurodegeneration verbunden ist. Jüngste Studien zeigten, dass Plectin in Form einer Vielzahl durch differentielles Splicen erzeugter gewebespezifischer Isoformen mit unterschiedlichen aminoterminalen Enden exprimiert wird. Hauptziel des beantragten Projektes ist (i) die Charakterisierung molekularer Interaktionen von Plectin-Isoformen an der Grenzschicht zwischen Cytoskelett und Plasmamembran, einschliesslich bereits bekannter Plectin- Bindungsproteine, wie der Intermediärfilament- und Mikrofilamentproteine, Vimentin und Actin, und den mit Membran-Proteingerüst und Verankerungskomplexen assoziierten Proteinen Integrin alpha7 und beta4, beta- Dystroglycan, Spectrin, Utrophin, und alpha-Actinin. (ii) Biochemische Analyse der Rolle Plectins als Gerüst und Anlegestelle für Proteine mit wichtigen Funktionen bei der Signaltransduktion, wie die ubiquitäre cytoplasmatische Tyrosinkinase Fer und RACK1. (iii) 3-Dimensionale Analyse funktionell wichtiger Proteindomänen, einschliesslich der multifuntionellen Actinbindungsdomäne und der carboxy-terminalen Repeat-Domänen von Plectin. Der experimentelle Ansatz beruht überwiegend auf der Expression rekombinanter zu einzelnen Subdomänen korrespondierender Proteine in Bakterien (oder Baculovirus-infizierten Insektenzellen), und der Struktur- Funktionsanalyse dieser Proteine und Proteinkomplexe unter Verwendung einer Kombination von biochemischen, biophysikalischen, kristallographischen und. zellbiologischen Methoden. Zusätzlich soll das Hefe-2-Hybrid System als Werkzeug zur Identifizierung neuer Plectin-Bindungsproteine zum Einsatz kommen. Dieser Ansatz sollte eine umfassende biochemische Analyse der Rolle Plectins als multifunktionelles cytoskelettäres Vernetzungs- und Gerüstprotein ermöglichen und zu wichtigen Erkenntnissen hinsichtlich der Struktur und molekularen Mechanik von Cytoskelett-Membran-Übergängen und deren Störungen in pathologischen Situationen führen.

Plectin ist der Prototyp einer erst vor kurzem entdeckten weitverbreiteten Familie von funktionell vielseitigen, und sehr großen (>500 kDa) Cytoskelett-Linkerproteinen. Plectin spielt sowohl beim Menschen als auch in der Maus bei der Stabilisierung von Zellen gegen mechanische Beanspruchung eine wichtige Rolle. Sein Fehlen ruft schwere Hautblasenbildung, Muskeldystrophie und Degeneration von Nervenzellen hervor. Im soeben abgeschlossenen Projekt untersuchten wir die molekularen Eigenschaften von Plectin auf biochemischer Ebene, wobei wir unser Augenmerk zunächst auf eine Andockstelle von Plectin richteten, die als Brücke zu Intermediärfilamenten, dem widerstandsfähigsten Cytoskelettfilamente-System in der Zelle, dient. Wir konnten feststellen, dass die als Cysteinbrücken bekannten Strukturelemente diese Domäne stabilisieren. Mit Hilfe von Computermodellen konnten wir ihre Lage in einem dreidimensionalen Molekülmodell bestimmen. Anschließend wurde die Actinbindungsdomäne von Plectin (ABD), ein weiterer wichtiger Teil des Moleküls, in Bakterien exprimiert, gereinigt und kristallisiert sowie ihre atomare Struktur mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt. Im Laufe dieser Arbeiten entdeckten wir, dass sehr kurze alternative, dieser Domäne vorangehende und durch differentielles Genspleißen entstandene Sequenzen die Eigenschaften und die Funktion des restlichen Moleküls selbst innerhalb ein und derselben Zelle bestimmen. Diese Erkenntnis eröffnet eine interessante neue Perspektive auf die Frage, wie Zellen verschiedene Funktionen von Cytolinkerproteinen verändern und aufeinander abstimmen, worauf wir in zukünftigen Untersuchungen weiter nachzugehen planen. Aufbauend auf anderen im Zuge dieser Projektarbeiten gewonnenen Daten konnte eine neue Hypothese zu Cytolinkerfunktionen aufgestellt und bestätigt werden, die weit über die bisher anerkannte Rolle als mechanische Zellstabilisatoren hinausgeht. Wir stellten fest, dass Plectin dank seiner großen Oberfläche, der Multidomänenstruktur und der vielseitigen Bindungsaktivitäten als Gerüst und Plattform für Signalkomplexe dient. Im speziellen konnten wir die Hypothese für die cytoplasmatische Tyrosinkinase Fer, den PKC-aktivierendes Protein RACK1-Proteinkinase C Komplex sowie für die Muskel-AMP-Kinase, das für das Energiehaushaltsgleichgewicht bedeutsamste Enzym, beweisen. Weiters stellten wir fest, dass eine der Plectinvarianten an eine am Proteinabbau beteiligte Ubiquitinligase bindet. Plectin dient nicht nur als Andockstelle für diese Enzyme, wie wir anhand der 3 untersuchten Kinasen zeigen konnten, sondern bestimmt auch ihre Signalaktivität. Cytolinkerproteine wie Plectin sind daher möglicherweise ein seit langem gesuchtes fehlendes Glied in cytoplasmatischen Signalübermittlungswegen. Wir nennen dieses neue Konzept "Plattform-Hypothese". Ihre Gültigkeit in zukünftigen Untersuchungen weiter zu testen und zu festigen stellt für uns wegen der Tragweite ihrer Bedeutung eine interessante Herausforderung dar.