Phosphatidylethanolamin

Forschungsprojekt P 14468 PhosphatidylethanolaminGünther DAUM26.06.2000 Das vorliegende Projekt beschreibt die Identifizierung von Lipidtransportrouten in Mitochondrien und Versuche zur Identifizierung von Komponenten, die an diesem Prozeß beteiligt sind. Die vorgeschlagenen Experimente basieren auf der Erkenntnis, daß Phosphatidylethanolamin (PtdEtn) ein essentielles Lipid der Mitochondrien ist. PtdEtn kann durch die mitochondriale Phosphatidylserindecarboxylase 1 (Psd1p) gebildet werden. Dieses Enzym benötigt als Substrat Phosphatidylserin (PtdSer), das im Endoplasmatischen Reticulum gebildet wird und von dort in die Mitochondrien importiert werden muß. In psd1 Deletionsmutanen sind Psd2p, ein extramitochondriales Isoenzym der Psd1p, und der extramitochondriale Kennedy-Weg (CDP-Ethanolamin-Weg) die einzigen Quellen für mitochondriales PtdEtn. Um die Beiträge der beiden Deacarboxylasen und des Kennedy-Wegs zur Versorgung der Mitochondrien mit PtdEtn zu studieren, werden Mitochondrien von Mutanten mit Deletionen in den entsprechenden Stoffwechselwegen auf ihre Lipidzusammensetzung analysiert. Markierungsexperimente mit radioaktiven Vorstufen unter Verwendung von Stämmen mit Defekten in Psd1p, Psd2p oder Kennedy-Weg-Enzymen werden zur Verfolgung der beteiligten Transportrouten des PtdEtn herangezogen. Spezies-Analyse mitochondrialen PtdSer, PtdEtn und Phosphatidylcholins, (PtdCho) durch chromatographische Methoden und durch Elektrospray-Tandem- Massenspektrometrie werden Aufschlüsse über die Spezifität der Verwendung bestimmter Phospholipid-Spezies für die Biogenese mitochondrieller Membranen liefern. Um die spezielle Funktion von PtdEtn in Mitochondrien zu untersuchen werden psdl, psd2 und psdlpsd2 Mutanten auf ihre mitochondriale Membranstruktur, korrekten Einbau von Proteinen und Lipiden sowie funktionelle Eigenschaften der Mitochondrien getestet. Der durch die Deletion von PSD1 hervorgerufene Mangel an PtdEtn in Mitochondrien führt zu charakteristischen phenotypischen Defekten. Dieselben Defekte werden erwartet, wenn der Import von PtdSer, dem Substrat für Psd1p, gestört ist. Basierend auf dieser Voraussage werden verschiedene genetische Screenings vorgeschlagen, um nicht-essentielle, essentielle und/oder redundante Genprodukte zu detektieren, die am Import von PtdSer An Mitochondrien beteiligt sind. Die Hefe bietet sich auf Grund der etablierten Methoden der Molekularbiologie und Zellbiologie für diese Untersuchungen an.

Ziel dieses Projekts war das Studium der zellbiologischen Rolle von Phosphatidylethanolamin (PtdEtn), einem der wichtigsten Phospholipide der Hefe Saccharomyces cerevisiae, insbesondere im Hinblick auf dessen Funktion in Mitochondrien. Molekularbiologische, zellbiologische und biochemische Methoden wurden zur Bearbeitung dieser Fragen angewandt. Unseren Studien zeigten zum ersten Mal die essentielle Rolle von PtdEtn als zelluläre und mitochondriale Komponente der Hefe. Die Synthese von PtdEtn in Hefe kann auf drei Wegen erfolgen: (i) Decarboxylierung des Precursors Phosphatidylserin (PtdSer) durch die PtdSer-Decarboxylase 1 (Psd1p) erfolgt in Mitochondrien; (ii) Decarboxylierung von PtdSer durch PtdSer-Decarboxylase 2 (Psd2p) ist im Golgi-Apparat lokalisiert; und (iii) Einbau von Ethanolamin über den CDP-Ethanolamin-Weg ist dem Endoplasmatischen Reticulum (ER) zuzuordnen. Um den relativen Beitrag dieser drei Wege zur Produktion des zellulären und mitochondrialen PtdEtn zu bestimmen, wurden Markierungsexperimente in vivo unter Verwendung entsprechende radioaktiver Precursoren und massenspektrometrische Analysen von Produkten und Intermediaten mit Mutanten durchgeführt, die Defekte in den einzelnen Synthesewegen aufweisen. Diese Experimente zeigten, dass Psd1p die größte Menge an zellulärem und mitochondrialem PtdSer synthetisiert, dass aber durch Psd2p und den CDP-Ethanolamin-Weg gebildetes PtdEtn in Mitochondrien importiert werden kann. Im Gegensatz zu mitochondrialem PtdEtn wird microsomales PtdEtn hauptsächlich durch den CDP-Ethanolamin-Weg gebildet. Somit spielen die verschiedenen Wege der PtdEtn Synthese verschiedene Rollen beim Einbau von PtdEtn in zelluläre Membranen. Um Komponenten zu identifizieren, die an der Erhaltung des PtdEtn-Gehalts der Mitochondrien beteiligt sind, wurde eine Reihe genetischer Screenings durchgeführt. Verschiedene Strategien wurden angewandt um der Tatsache Rechnung zu tragen, dass Proteine, die am Einbau von PtdEtn in mitochondriale Membranen beteiligt sind, essentiell sein könnten oder als Iso-Formen mit überlappender Funktion vorliegen. Die Grundlage dieser Screenings war (i) die Auxotrophie von Mutanten mit Defekten in den verschiedenen Wegen der PtdEtn Synthese, (ii) synthetische Letalität dieser Mutationen mit Defekten an zusätzlichen Komponenten, die an der PtdEtn Homöostase in Mitochondrien beteiligt sind, oder (iii) die Suppression der Defekte, die zu einem verbesserten Einbau von PtdEtn in Mitochondrien führt. Als alternative Strategie wurden Mutanten mit Defekten in der mitochondrialen Atmung (petite Mutationen) hinsichtlich veränderter mitochondrialer Lipidmuster getestet. Alle diese Strategien führten zur Identifizierung einer Reihe neuer Gene bzw. Genprodukte, deren funktionelle Analyse Gegenstand laufender Untersuchungen ist. Diese Arbeiten werden im FWF Projekt 17321 fortgesetzt.