Mechanismus der Transkriptionskontrolle durch Act3p

Forschungsprojekt P 14452Mechanismus der Transcriptionskontrolle durch Act3pUlrike WINTERSBERGER08.05.2000 In jeder lebenden Zelle ist die Umsetzung der in den Genen gespeicherten Information streng geregelt. Der erste Schritt auf dem Wege zu einem funktionierenden Protein ist die Transkription des codierenden Gens in die messenger-RNA, welche sodann in Protein übersetzt wird. In Eukaryonten (zu denen einerseits einzellige Organismen wie die Bäckerhefe, andererseits alle vielzelligen Organismen wie etwa der Mensch, gehören) ist die informationstragende DNA in Nucleosomen verpackt, welche die erste Kondensationsstufe der Chromatin-Struktur bilden. Wegen dieser Verpackung sind Regulationssequenzen von Genen in Abhängigkeit von der Chromatin- Struktur für Regulationsfaktoren entweder zugänglich oder nicht. Daher kommt, wie erst vor kurzer Zeit erkannt, dem Chromatin nicht nur eine strukturierende sondern eine wichtige regulatorische Rolle zu. Durch sogenannte chromatin-modulierende Komplexe können unter Energieaufwand (ATP-Hydrolyse) Nukleosomen verschoben oder entfernt werden, durch chromatin-modifizierende Komplexe werden die die Nuclosomen bildenden Histone chemisch verändert, wodurch die Chromatin-Struktur gelockert oder verfestigt werden kann. Diese Komplexe bestehen aus jeweils mehr als 10 teilweise noch nicht charakterisierten Untereinheiten. Ebenso ist zu erwarten, daß weitere noch unbekannte Komplexe existieren. In der Abteilung für Molekulare Genetik des Instituts für Krebsforschung wurde vor einigen Jahren ein Protein der Bäckerhefe entdeckt, das Homologien zu Aktin (einem Strukturprotein jeder Eukaryonten-Zelle) aufweist und das wir Act3p genannt haben. Bisher wissen wir, daß Act3p im Zellkern lokalisiert ist und daß es für das Überleben der Zellen notwendig ist. Aus den Resultaten eines US- Labors ist bekannt, daß Act3p Einfluß auf die Transkriptionsregulation hat, da Überlebensfähige Mutanten (im ACT3 Gen) eine Veränderung bei der Transkription eines bestimmten Gens zeigen. Außerdem haben wir gemeinsam mit Dr. Masahiko Harata (Universität Sendai, Japan) Bindung von Act3p an Histone beobachten können. Es liegt daher (und aus anderen Beobachtungen) nahe, daß Act3p eine Untereinheit einens die Chromatin- Struktur beeinflussenden Komplexes ist. In Zusammenarbeit mit Dr. Harata wollen wir einerseits die Eigenschaften des Act3-Proteins erforschen, andererseits feststellen, an welchem Komplex es beteiligt ist und die Regulation welcher Gene es beeinflußt. Wir werden gentechnisch diverse Mutationen in das ACT3 Gen einführen und die Wirkung solcher Mutationen in ganz bestimmten Bereichen des Moleküls in vitro und in vivo untersuchen. Außerdem wollen wir klären, ob die von Dr. Harata isolierten humanen Gene das Hefe-Act3p in Hefezellen ersetzten können, um so Hinweise für die Funktionen der menschlichen Gene zu erhalten. In einer Reihe von menschlichen Erkrankungen, z.B. bei der Tumor-Entstehung, aber auch beim Alterungsprozess, kommt es zu Störungen bei der Transkriptionskontrolle. Wir hoffen somit neben dem grundlegenden Erkenntniswert unserer geplanten Arbeit auch einen möglichen Beitrag zum Verständnis mancher Krankheiten leisten zu können.

Ein gut geeigneter Model-Organismus, der erstaunlich nahe mit höheren Organismen, zB. dem Menschen, verwandt ist. So gibt es auch zu "unserem" Act3p zwei verwandte menschliche Proteine. Diese sind wie Hefe- Act3p Bestandteile einiger Chromatin modulierender Complexe. Mittels einer neuen Methode, der Microarray-Analyse, mit der man das Ausmaß der Expression von gleichzeitig vielen Genen studieren kann, fanden wir, daß Act3p bei der Regulation der Stress-Gene gebraucht wird. Die Produkte dieser Gene, die Stress-Proteine, dienen den Zellen zum Schutz gegen für sie bedrohliche Lebensbedingungen. Sie werden nur synthetisiert, wenn die Zelle mit ihren Rezeptoren (ähnlich Antennen) aus ihrer Umgebung Information von zB. Hitze, Es ist bekannt, daß die Eigenschaften von Lebewesen durch die Gene bestimmt werden. Die "Anwendung" der Gene (ihre Expression) muß unter dem Einfluß der jeweiligen Lebensbedingungen eines Organismus gesteuert werden. Bis vor kurzem glaubte man, daß diese Steuerung vorwiegend von Transcriptionsfaktoren, i.e. Protein-Molekülen, die an die Sequenzen vor den zu regulierenden Genen an der DNA binden und deren Expression entweder aktivieren oder reprimieren. Das Genom (die Gesamtheit der Gene und zahlreicher DNA Sequenzen dazwischen) der Eukaryonten ist mit den Histon-Proteinen in das Chromatin verpackt; man nahm an, daß dies eine weitgehend stabile Struktur sei. Heute wissen wir jedoch, daß Chromatin ein dynamisches Gebilde ist, dessen Struktur für die Anwendung der Gene, also deren Transkription in RNA, immer wieder verändert wird. Dazu sind die das Chromatin modulierenden Complexe notwendig, die jeder aus etwa 10 unterschiedlichen Proteinen zusammengesetzt sind. Vor einigen Jahren fanden wir in der Bäckerhefe ein überlebensnotwendiges Protein, das wir wegen seiner Verwandtschaft zum Muskel-Aktin Act3p nannten. Die Bäckerhefe ist als einfacher Einzeller abnormalem Säuregrad, Giften oder gefährlichen Strahlen bekommen. Unter günstigen Lebensbedingungen werden diese Proteine nicht hergestellt, es wäre Verschwendung. Wir fanden diese Verschwendung jedoch in Zellen, die ein mutiertes (verändertes und in seiner Funktionsfähigkeit eingeschränktes) Act3p enthalten. Diese Zellen wachsen langsamer, da sie Energie auf die Synthese nicht notwendiger Proteine verwenden. In der Natur würden sie schnell von den gesunden Verwandten überwuchert. Auch einige weitere Gen-Gruppen werden durch die Mutation von Act3p falsch exprimert. Die wohldosierte Gen-Expression ist für die Gesundheit eines jeden Lebewesens äußerst wichtig, daher ein von vielen Forschergruppen eifrig studiertes Gebiet. Natürlich wollen wir auch den Mechanismus der Act3p-Wirkung auf die Gen-Expression erforschen. Im Zuge des gegenständlichen Projekts konnten wir mit Experimenten einige interessante Hinweise erlangen: Act3p bindet so wie das verwandte Aktin das kleine Adenosin-Triphosphat-Molekül (ATP), allerdings schwächer als Aktin. Wahrscheinlich ist die Struktur des Act3p etwas verschieden, je nachdem, ob es ATP enthält oder nicht. Aus unseren Experimenten schließen wir, daß Act3p das ATP abgibt, wenn es einen Complex verläßt, sodaß der Complex entweder umgebaut oder vom Chromatin abgelöst werden kann. Somit ist Act3p an der wichtigen Dynamik der Chromatinstruktur maßgeblich beteiligt.