Charakterisierung der Squalenepoxidase in Hefe

Forschungsprojekt P 14415Charakterisierung der Squalenepoxidase in HefeFrederike TURNOWSKY08.05.2000 Sterole sind essentielle Bestandteile eukaryonitischer Membranen. In Pilzen ist Ergosterol das charakteristische Sterol, welches strukturell und funktionell dem Cholosterin in tierischen Zellen entspricht. Die Hemmung der Biosynthese dieser Moleküle wird medizinisch genützt zur Therapie von Pilzinfektionen bzw. zur Senkung des Cholosterinspiegels. Ein Schlüsselenzym in der Synthese von Ergosterol ist die Squalenepoxidase (Erglp). Es ist ein essentielles Enzym und stellt das Zielenzym für eine Gruppe hochwirksamer antifungaler Substanzen, die Allylamine, dar. Der genaue Mechanimus der Epoxidierungsreaktion ist ebenso ungeklärt wie die Frage, auch welche anderen Proteine an der Reaktion beteiligt sind, ist noch ungeklärt. Es ist daher ein Ziel, die Squalenepoxidase aus Saccharomyces cerevisiae als Fusionsprotein zu experimieren, zu reinigen und mit dem gereinigten Protein einerseits die Interaktion mit dem Inhibitor Terbinafine zu untersuchen und andererseits mögliche Interaktionespartner im endoplasmatischen Reticulum zu identifizieren. Die Aufklärung der Röntgenstruktur des Erg1 Proteins ist, unter anderem auch für die Suche nach neuen Inhibitoren, von besonderer Bedeutung. Obwohl die Synthese von Ergosterol sehr gut untersucht und charakterisiert ist, gibt es nur wenig detaillierte Information über die Regulation der Biosynthese. Wir konnten zeigen, daß die Hemmung verschiedener Schritte der Ergosterolbiosynthese, die zu einem Ergosterolmangel in der Zelle führt, eine verstärkte Expression der Squalenepoxidase induziert. Wir konnten auch ein neues DNA Element in der Promoterregion des Squalenpoxidasegens (EEG1) identifizieren, das an der durch den Ergosterolgehalt regulierten Genexpression beteiligt ist. Das zweite Ziel im Projektantrag ist daher die Identifizierung des Transkriptionsfaktors, der durch Ergosterolmangel entweder verstärkt exprimiert oder aktiviert wird, und die Aufklärung des Regulationsmechanismus der ERG1 Expression.