Interaktion von HPV-16 E7 mit zellulären Proteinen

Forschungsprojekt P 14288Interaktion von HPV-16 E7 mit zellulären ProteinenPidder JANSEN-DÜRR06.03.2000 Ziel des geplanten Projektes ist es, die Wechselwirkung des E7-Onkoproteins von HPV-16 mit zwei in der Arbeitsgruppe identifizierten zellulären Interaktionspartnern, dem IGF-Bindungsprotein 3 (IGFBP-3) und der Pyruvatkinase vom Typ M2 (M2-PK), auf der Ebene der molekularen Strukturen zu untersuchen. Zum einen soll versucht werden, durch geeignete biophysikalische Methoden die Zusammensetzung von E7 enthaltenden Komplexen zu definieren; dazu soll eine neue Technik entwickelt werden, um E7 enthaltende Komplexe, in Zellextrakten charakterisieren zu können. Außerdem ist geplant, durch eine Mutationsanalyse diejenigen Domänen in IGFBP-3 und M2-PK zu bestimmen, welche jeweils für die Bindung des E7-Proteins von Bedeutung sind. Des weiteren sollen im Labor bereits entwickelte synthetische Peptide dazu verwendet werden, die Bindung von E7 an definierte zelluläre Regulatorproteine in vitro aufzuheben, etwa in Kompetitionsexperimenten. Schließlich soll geprüft werden, ob die Veränderung der Funktion von IGFBP-3 durch E7 genetisch mit der Bindung von E7 an IGFBP-3 korreliert. Sollte die gleichzeitig in einem Parallelprojekt durchgeführte NMR-Strukturanalyse des E7 Proteins erfolgreich verlaufen, so ist geplant, in dem hier beschriebenen Projekt entsprechende Strukturdaten auch für Komplexe aus E7 und IGFBP-3 zu ermitteln. Besonders interessant erscheint dabei die Frage, ob die Bindung von E7 an lGFBP-3 durch eine neuartige Zinkfingerstruktur stabilisiert wird. Insgesamt sollten die geplanten Experimente die Basis dafür schaffen, neue Strategien zu entwickeln, um die Bindung von E7 an definierte zelluläre Proteine durch niedermolekulare Inhibitoren aufzuheben.

Wesentliches Ziel des Projekts war eine Analyse von molekularen Interaktionen des E7 Onkoproteins von HPV-16 mit zellulären Regulatorproteinen. E7 ist das entscheidende Onkoprotein des humanen Papillomavirus 16 (HPV-16) und spielt eine Schlüsselrolle bei der virusabhängigen Tumorentstehung. Um neue Informationen über Wechselwirkungen zwischen E7 und relevanten zellulären Partnerproteinen zu erhalten, wurde eine Serie synthetischer Peptide identifiziert, welche an verschiedene funktionelle Domänen des E7 Onkoproteins binden. Derartige Peptide wurden erhalten und es konnte gezeigt werden, dass mit diesen Peptiden die Interaktion zwischen E7 und verschiedenen zellulären Regulatorproteinen sowohl in vitro als auch in vivo beeinflusst werden kann. Weiters wurde eine neuartige Interaktion zwischen E7 und dem glykolytischen Enzymkomplex nachgewiesen. Insbesondere konnten wir zeigen, dass E7, vermittelt über eine Bindung an M2 Pyruvatkinase, die Zusammensetzung des glykolytischen Enzymkomplexes verändert, woraus eine Neuprogrammierung des Zuckerstoffwechsels resultiert. Dies hat zu einer neuen Hypothese geführt, wonach E7 und Ras kooperieren um das sogenannte Tumormetabolom zu generieren, welches für eine erfolgreiche Transformation von Säugerzellen unerlässlich ist. Im weiteren Verlauf des Projektes wurde ein Protokoll etabliert, um die E7 Proteine von drei HPV- Typen (HPV-16, HPV-18 und HPV-45) in E coli zu exprimieren und in nativer Form bis zur Homogenität aufzureinigen. Die biophysikalische Analyse des E7 Onkoproteins von HPV-16 erbrachte neue Einsichten in dessen molekulare Struktur. Insbesondere wurde gezeigt, dass E7 zu der Gruppe von relativ seltenen Proteinen gehört, welche in der nativen Konformation zum Teil ungefaltet vorliegen. Diese Eigenschaft von E7 ist wahrscheinlich im Zusammenhang zu sehen mit der in der Literatur gut dokumentierten Fähigkeit von E7, an eine größere Anzahl verschiedener zellulärer Partnerproteine zu binden. In der Folge wurden mit den rekombinanten E7 Proteinen der drei genannten HPV-Typen polyklonale Antiseren produziert. Diese Antiseren erwiesen sich als geeignet, um das E7-Protein in Biopsien von Cervix-Karzinom-Patientinnen nachzuweisen. Weiterhin fanden wir, dass die Expression von E7 und dem Retinoblastoma-Protein in Zervix-Karzinorn-Biopsien einander ausschließen. Dies wird interpretiert als ein erster Anhaltspunkt dafür, dass E7, wie bereits in Zellkulturexperimenten gezeigt, auch in vivo eine Degradation des Retinoplastomaproteins herbei führen kann. Zusammengenommen scheinen die im Projekt gewonnen Erkenntnisse geeignet als Basis für neue Experimente, welche zu einem besseren Verständnis des Zervix-Karzinoms ebenso beitragen können wie zu einer Verbesserung der Frühdiagnose dieser Erkrankung.