Struktur und Funktion des CLR Motivs

Forschungsprojekt P 14285Struktur und Funktion des CLR MotivsMario GIMONA08.05.2000 Ein auffälliges strukturelles Merkmal des Glattmuskel Protein Calponin (CaP) sind dessen drei, jeweils Aminosäuren lange Repeats am C-terminalen Ende des Moleküls. CaP verwandte Proteine, die ebenfalls solche repetitive Sequenzen aufweisen, finden sich in Bertebraten und Invertebraten sowie bzw. OVHefe. In C.elegans und O.volvulus, zwei Vertreter der Familie der Plattwürmer, wurden Proteine gefunden (UNC 87 bzw. OV9M) die ausschließlich aus sieben Kopien dieser repetitiven Sequenzen bestehen und diese Protein co-lokalisieren mit dem Actomyosin System der Körpermuskulatur dieser Nematoden. In CaP bilden die drei Repeats eine zweite, unabhängig funktionierende Aktin Bindungsstelle. In Abwesenheit anderer potentieller Aktin Bindungsmptive ist daher ahnzunehmen, daß UNC 87 die Aktin Bindung über diese Repeats bewerkstelligt. Eine genaue Analyse der Sequenzen aller Proteine in denen eine (SM 22, Transgelin, Myophilin, Scp1p) oder meherere (UNC 87, OV9M) homologe Kopien dieser Sequenz vorliegen verdeutlicht, daß es bei diesem Modul um ein archetypisches Aktin Bindungsmotif handeln dürfte, welches im Verlauf der Evolution in seinen Grundzügen nahezu unverändert geblieben ist. In dem vorliegenden Projekt beabsichtigen wir die Wechselwirkung dieses "CLR" (valponin-like repeat) Motivs mit filamentösem Aktin genauer zu untersuchen. Im Besonderen wollen wir die Frage beantworten, ob die Unteraktion mit Aktin direkt oder mittels einer sekundären Wechselwirkung mit einem weiteren Aktin- bindenden Protein wie Tropomyosin verläuft. In Experimenten an lebenden Kulturzellen beabsichtigen wir die zellulären Effekte des CLR Motivs auf die Stabilität und den Umsatz des Aktin Zytoskeletts zu verfolgen. Darüber hinaus planen wir die dreidimensionale Struktur verschiedener CLR Motive unterscjiedlicher CLR Motive unterschiedlicher Länge bzw. Kopienzahl von CaP und UNC 87 zu entschlüsseln. Die Ergebnisse dieser Studie werden neu Einsichten in die Struktur und Funktion eines neuen, konservierten, aber gleichzeitig in seiner Ausformung variablen Protein Moduls erlauben. Eine präzisere Kenntnis des molekularen Aufbaus von Zytoskelett modulierenden Protein sollte wichtige Daten für zukünftige Sequenz- und Struktur geschützte Vorhersagen von neuen Aktin modulierenden Preinen liefern. Aufgrund der weiteren Bearbeitung dieses Moduls und seiner immunologischen Eigenschaften werden die Ergebnisse auch für die Gebiete der Parasitologie und Immunologie von Bedeutung sein.

Ziel dieses Projektes war die Entschlüsselung der molekularen Grundlagen für die Wechselwirkung des CLIK 23 Protein Moduls mit dem Aktomyosin System. Wir konnten zeigen, dass Mitglieder der Calponin (CaP) Molekül Familie unterschiedliche Rollen in der Stabilisation und Regulation des Aktin Zytosklettes spielt. Der Nachweis, dass UNC-87 (ein Muskelprotein des Fadenwurmes C. elegans) ein Aktin-bindendes Protein ist hat bewiesen, dass das CLIK 23 Modul ein, in der Evolution konserviertes, archetypisches Bindungsmodul darstellt. Aktin Fasern die mit CaP dekoriert sind weisen eine höhere Stabilität gegenüber der durch Gabe von Phorbolester (PBDu) induzierten Formierung von Podosomen auf als jene, die SM22 gebunden haben. Daher scheint die Balance der Expression von CaP und SM22 die Stabilität bzw. die Dynamik des Aktin Zytoskelettes in glatten Muskeln zu regulieren. Wir haben darüber hinaus den Nachweis dafür erbracht, dass multiple Kopien des CLIK 23 Moduls und die daraus resultierende Aktin Interaktions Oberfläche als molekulare Grundlage für die Stabilisation des Aktin Zytoskelettes (sowohl in Muskel als auch in Nicht-Muskel Zelltypen) hinreichend und notwendig sind. Aufbauend auf diese Ergebnisse haben wir die Hypotheses aufgestellt, dass CLIK 23 Module dem Aktin Zytoskelett eine Art "konformationeller Stabilität" verleihen und dadurch eine unterscheidbare Subpopulation von Aktin Filamenten mit abweichender Stabilität innerhalb der Zelle schaffen. Diese Arbeiten eröffnen einen gänzlich neuen Zugang hinsichtlich der Regulation und Plastizität glatter Muskeln. Unsere Arbeiten haben gezeigt, dass Zellen der vaskulären glatten Muskulatur in der Lage sind Podosomen zu bilden, ein Potential welches die Eigenschaft des kontinuierlichen Umbaus des Aktin Zytoskeletts widerspiegeln dürfte. Die Glattmuskel spezifische Isoform h1CaP inhibiert die Formierung von Podosomen und eine Reduktion der Expression von h1CaP wurde in einer Reihe von Tumoren wie dem Fibrosarkom oder Osteosarkom beschrieben. Diese Faktoren weisen eindeutig auf eine direkte Korrelation zwischen h1CaP Expression, Podosomen Formierung und der Bildung von Glattmuskel Tumoren hin. Ein weiterer wichtiger Aspekt unserer Arbeiten ist die Etablierung der A7r5 Glattmuskelzelllinie als verlässliches in vitro Modell für i) die Untersuchung glattmuskelspezifischer Protein-Protein Wechselwirkung, und ii) für die Untersuchung der Podosomen-Formierung in lebenden Zellen.