Transportwege des PCI in/aus Zellen

Forschungsprojekt P 14204Transportwege des PCI in/aus ZellenMargarethe GEIGER 24.01.2000 Protein C Inhibitor (PCI) ist ein Mitglied der Serpin (Serinprotease-Inhibitoren) Familie. Er hemmt eine Vielzahl von Serinproteasen (z.B. Gerinnungsfaktoren, Plasminogenaktivatoren, Gewebekallikrein, Akrosin) durch die Bildung stabiler, enzymatisch inaktivver 1:1 Komplexe. PCI wird in verschiedenen Organen und Geweben synthetisiert und kommt in vielen Körperflüssigkeiten und Sekreten vor. Die biologische Funktion von PCI ist nach wie vor ungeklärt. Eine Hauptquelle für PCI scheinen Epithelien zu sein, welche innere und äußere Körperoberflächen auskleiden. Wir konnten vor kurzem zeigen, dass PCI auch in Thrombozyten vorkommt und von Megakaryozyten synthetisiert wird. Vorläufige Befunde weisen darauf hin, dass in Megakayozyten, aber auch in neutrophilen Granulozyten PCI-Antigen im Kern enthalten ist. Weiters haben wir Daten, die darauf hindeuten, dass PCI eine Funktion als Hormon (Retinoid)-bindendes Protein haben dürfte. VonEpithelien synthetisierter PCI könnte theoretisch ein Vielzahl biologischer Funktionen ausüben (z.B. Hemmung extrazellulärer und/oder intrazellulärer/intranikleärer Proteasen, Hemmung bakterieller Proteases, Bereitstellung von Retinoiden). Es gibt jedoch noch eine Vielzahl offender Fragen, nicht nur was mögliche Zielproteasen des PCI befrifft, sondern auch hinsichtlich der physiologischen "Mikro"-Umgebung des PCI. Es ist im speziellen unklar, ob PCI gerichtet durch die apikale Epithelzell-Membran oder aber in alle Richtungen sezerniert wird. Auch eine mögliche intrazelluläre Lokalisation ist bisher nicht erforscht. Im vorliegenden Projekt möchten wir daher die zelluläre Transportwege des PCI analysieren. Weiters möchten wir versuchen, lokale Zielmoleküle (Proteasen, Bindungsproteins usw.) des PCI in der jeweiligen "Mikro"-Umgebung zu identifizieren. Im speziellen werden wir untersuchen ob bzw. wie PCI in Epithelzellen sortiert wird, und in welchen intrazellulären Kompartments er lokalisiert ist. Wir werden weiters eine mögliche nukleäre Translokation des PCI in Epithelzellen und Leukozyten analysieren. Außerdem werden wir die Möglichen Molekülformen des PCI (frei, komplexiert, gespalten usw.) in den einzelnen Kompartments (intrazelulär, extrazellulär) untersuchen und versuchen, lokale Zielmoleküle in diesen Kompartments zu identifizieren. Dieses Projekt sollte somit die erste Studie darstellen, in der PCI in seiner physiologischen "Mikro"-Umgebung untersucht wird. Von den Ergebnissen dieser Untersuchungen erwarten wir uns daher nicht nur neue Erkenntnisse, sondern - falls wir eine nukleäre Translokation des sezernierten PCI nachweisen können - auch vollkommen neue, zellbiologische Erkenntnisse.

Im Rahmen dieses Projektes konnten wir einen völlig neuen Mechanismus der zellulären Aufnahme und Kerntranslokation eines sezernierten Proteins (Protein C Inhibitor; PCI) identifizieren und charakterisieren. Protein C Inhibitor (PCI) ist ein unspezifischer Inhibitor von proteolytischen Enzymen (z.B. Blutgerinnungsfaktoren), der in vielen Organen synthetisiert und in die Umgebung sezerniert wird. Die Hemmung von Enzymen erfolgt in der Weise, dass PCI und Enzym einen sehr stabilen 1:1 Komplex bilden, der enzymatisch nicht mehr aktiv ist. In Voruntersuchungen zu diesem Projekt machten wir in immunhistochemischen Untersuchungen die Beobachtung, dass PCI auch im Zellinneren lokalisiert sein dürfte, und zwar insbesondere im Zellkern von Leukozyten. Dieser außergewöhnliche Befund, dass nämlich ein sezerniertes, extrazelluläres Protein im Zellkern zu finden ist, veranlasste uns, im Rahmen dieses Projektes die Mechanismen einer eventuellen Internalisierung von PCI durch Zellen bzw. seine Translokation in den Zellkern zu analysieren. Mit Hilfe von unterschiedlichen monoklonalen Antikörpern konnten wir in elektonenmikroskopischen Untersuchungen bestätigen, dass PCI tatsächlich im Kern von Leukozyten, und zwar assoziiert mit Heterochromatin, lokalisiert ist. Mit Hilfe von markiertem PCI konnten wir zeigen, dass dieser von Zellen aus dem umgebenden Medium aufgenommen und in den Kern transloziert werden kann. Die Aufnahme dürfte zumindest zum Teil sehr rasch direkt über Phospholipide der Zellmembran erfolgen, wobei wir durch kristallographische Untersuchungen (Kooperation mit einer Gruppe in Cambridge, UK) bereits Hinweise für eine Phospholipid-Bindungstelle im PCI Molekül erhielten. Den außergewöhnlichen Befund, dass ein Protein, nämlich PCI, direkt eine Phospholipid-Membran durchqueren kann, konnten wir mit Hilfe von Phospholipid-Vesikeln bestätigen. Mit Hilfe von PCI-Mutanten konnten wir bereits Hinweise dafür erhalten, welche Domänen innerhalb des PCI Muleküls für den Durchtritt von PCI durch Phospholipid-Membranen verantwortlich sind. Was die Translokation von PCI in den Zellkern betrifft, konnten wir ebenfalls Abschnitte im PCI-Molekül identifizieren, die dafür notwendig sind. Was die Funktion von PCI im Zellinneren, insbesondere im Zellkern betrifft, haben wir Hinweise dafür erhalten, dass er mit Proteasen reagiert und dabei gespalten wird. Außerdem konnten wir mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden einige mögliche Reaktionspartner für PCI identifizieren.