Entwicklung von Inhibitoren für humane Myeloperoxidase

Forschungsprojekt P 14187Entwicklung von Inhibitoren für humane MyeloperoxidaseChristian OBINGER 24.01.2000 Das humane Enzym Myeloperoxidase der neutrophilen Granulozyten spielt bei der Abwehr von Pathogenen eine entscheidende Rolle. Mit Hilfe von Wasserstoffperoxid vermag es Chlorid in das starke Oxidationsmittel Hypochlorit zu oxidieren, welches wahrscheinlich für den oxidativen Abbau der mittels Phagozytose aufgenommenen Fremdkörper (Bakterien, Viren) verantwortlich ist. Das Enzym scheint aber auch bei entzündlichen Gewebsschädigungen bei diversen Krankheiten prominent beteiligt zu sein (z.B. bei rheumatoider Arthritis oder Arterioskleorose). Der genaue Wirkmechanismus des Enzyms ist aber ungeklärt. Um die Rolle von Myeloperoxidase sowohl bei der Immunabwehr als auch bei entzündlichen Prozessen genauer studieren zu können, wird ein sehr spezifischer Inhibitor benötigt. Es ist nun das Ziel dieses Projektes Substanzen zu entwickeln, welche als sehr spezifische Substrate nur für dieses Enzyms fungieren können, dabei oxidiert werden und in der Folge das Enzym selbst ausschalten. Der exakte Inhibierungsmechanismus ist am gereinigten Protein selbst aufzuklären, aber auch die Wirkung dieser Stoffe auf Zellkulturen (neutrophile Granulocyten) im Hinblick auf künftige medizinische Anwendungen. Myeloperoxidase unterscheidet sich in einigen wichtigen Eigenschaften von anderen menschlichen Peroxidasen. Das Enzym wird viel rascher von seiner aktiven Form (dreiwertiges Eisen) in die inaktive Form (zweiwertiges Eisen) durch Reduktionsmittel überführt. Zudem vermag es durch sein sehr reaktives Intermediat Compound I eine Vielzahl von Substanzen zu oxidieren (z.B. Chloridoxidation). Die Strategie der gezielten Entwicklung von spezifischen Inhibitoren soll nun diese besonderen Eigenschaften ausnutzen. Sie wird u.a. auf Forschungsergebnissen aus Voruntersuchungen mit Benzoesäurehydraziden und Hydroquinonen als sog. Suicid- Substrate für MPO beruhen. Myeloperoxidase vermag diese Substanzen zu radikalischen Zwischenprodukten zu oxidieren, die nun ihrerseits das Enzym in eine inaktive Form überführen und in der Folge irreversibel inaktivieren. Es gilt den Reaktionsmechanisinus aufzuklären und Substratanaloga zu entwickeln, die in ihrer Wirkung noch stärker bzw. weniger toxisch sind. Dabei sind für die physiologische Funktion der MPO grundlegende Reaktionen erstmalig kinetisch zu erfassen (z.B. Bildung von Ferro-MPO, Anlagerung von Sauerstoff unter Bildung von Compound III, Umsatz von Compound III usw.). Weiters sollen die Enzymmodifikation aufgeklärt und sämtliche Reaktionsprodukte (metabolisierte Substratanaloga) charaktersiert und schließlich der Reaktionsmechanismus etabliert werden. Die ausgewählten Inhibitoren werden sowohl in vitro in Modellreaktionen als auch in vivo in Zellkulturen menschlicher Neutrophiler auf ihren Einfluß auf die Hypochlorit-Bildung als auch auf die Fähigkeit zum Abtöten von Bakterien untersucht.

Die humanen Peroxidasen Myeloperoxidase (MPO), Eosinophile Peroxidase (EPO) und Lactoperoxidase (LPO) sind Teil der unspezifischen Immunabwehr. Sie werden bei der Abwehr von pathogenen Mikroorganismen in hohen Konzentrationen freigesetzt und katalysieren durch Halogenierungs-, Nitrosylierungs- und Oxidationsreaktionen die Abtötung von Bakterien und Viren. Oftmals kommt es aber dabei auch zur oxidativen Schädigung körpereigener Gewebe und Entzündungen sind die Folge. MPO und EPO sind in speziellen weißen Blutzellen in hohen Konzentrationen vorhanden und ihre Plasma- bzw. Gewebskonzentration korreliert mit dem Infektions- und/oder Entzündungsgrad. Die humanen Peroxidasen werden daher mit der Pathogenese vieler Krankheiten in Zusammenhang gebracht, die in westlichen Gesellschaften eine bedeutende Rolle spielen, wie z.B. Atherosklerose oder Asthma. Es ist daher wichtig mehr über Struktur-Funktionsbeziehungen von humanen Peroxidasen zu wissen, um Inhibitoren zu entwickeln, die in späterer Folge vielleicht die Basis einer medikamentösen Intervention darstellen. Ziel dieses Projektes war daher die Entwickling eines Inhibitors, der in den MPO-typischen Reaktionsmechanismus eingreift und die Chloridoxidation inhibiert. Denn diese ist hauptsächlich für die Oxidationsschäden an Geweben verantwortlich. Die physiologische Rolle der anderen humanen Peroxidasen sollte dabei nicht angetastet werden. Ein vorranginges Ziel dieses Projektes war daher die Aufklärung der Halogenierungsreaktion der humanen Peroxidasen und die Charakterisierung der Enzymzwischenstufen. Zu diesem Zweck wurde eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe Reduktionspotentiale sehr kurzlebiger Intermediate bestimmt werden kann. Auf der Basis umfangreicher kinetischer und spektroskopischer Untersuchungen wurden die bislang effizientesten Inhibitoren für MPO entwickelt, nämlich 5-Chlorotryptamin und 5-Fluorotryptamin, die bereits in einer Konzentration von 0,7 M die Chlorierungsaktivität von MPO hemmen. Aufgrund des positiven Reduktionspotentials des MPO Redoxpaares Compound I/Compound II von 1,35 V, kann MPO Compound I (aber nicht EPO oder LPO Compound I ) diese Substanzen extrem rasch (1 x 107 M -1 s -1 bei pH 7) in den als Compound II bezeichneten Enzymzustand überführen. Da dieser aber nicht Teil des Halogenierungszyklus ist, wird die Chlorierungsaktivität inhibiert und die Freisetzung des starken Oxidationsmittels Hypochlorit unterbleibt.