Apolipoprotein Serum Amyloid A4 (SAA4)

Forschungsprojekt P 14186Apolipoprotein Serum Amyloid A4 [SAA4]Ernst MALLE 24.01.2000 Serum Amyloid A (SAA) ist der Überbegriff für eine Familie von Apolipoproteinen, die sich in zwei Hauptgruppen, (i) die akute-Phase SAA (A-SAA) und (ii) die konstitutiv-exprimierten SAA (C-SAA) Proteine, unterteilt. Die Gruppe der A-SAA Proteine zählt - neben dem C-reaktivem Protein - zur Hauptgruppe der positiven Akute-Phase Proteine, deren Plasmakonzentrationen während inflammatorischer Prozesse in vivo bis zum 1000- fachen der Ausgangskonzentration ansteigen. Neben der Rolle als Akute-Phase Proteine sind A-SAA Proteine Vorläuferproteine bei der sekundären, reaktiven Amyloidose und weiters die Hauptapolipoproteine der high- density-lipoprotein(HDL)-Fraktion während inflammatorischer Prozesse. Der Austausch von Apolipoprotein A-I (dem Hauptapolipoprotein der HDL-Fraktion) gegen A-SAA bedingt massive Änderung der biologischen, antiatherogenen Eigenschaften seines physiologischen "Carriers", dem HDL-Partikel. Im Gegensatz dazu zählt C- SAA, das ausschließlich beim Menschen und in der Mause nachgewiesen wurde, nicht zur Hauptgruppe der positiven Akute-Phase Proteine obwohl mittels in situ Hybridisierung eine Zytokin-induzierte Expression von C- SAA auf mRNA Ebene in Makrophagen-ähnlichen Schaumzellen humaner atherosklerotischer Läsionen von Koronar- und Karotis-Arterien sowie in humanen Endothel- und glatten Muskelzellen nachgewiesen wurde. Humanes C-SAA wird in der Leber synthetisiert, jedoch ist seine Funktion unbekannt. Preliminäre, eigene Untersuchungen haben gezeigt, daß humanes C-SAA (auch SAA4 genannt) sowie einige - der Primästruktur von SAA4 idente - Peptide, die intrazellulären Ca2+ -Konzentrationen in humanen Endothelzellen massiv erhöhen. Das Ziel dieses Projektantrages ist es, die diesem Phänomen zugrunde liegenden Mechanismen zu klären 1. ob humanes SAA4 an einen Rezeptor bindet ? 2. ob Kalzium-Kanäle in diesen Prozess involviert sind ? 3. ob ein G-Protein-abhängiger Aktivierungsprozess dabei involviert ist ? 4. ob Phospholipase C- und Protein-Kinase C-abhängige Mechanismen involviert sind ? 5. und ob eine Phospholipase A2 -abhängige Aktivierung die Eicosanoid-Kaskade durch Lipoxygenasen und den Cyclooxygenase Komplex (auf Protein- und DNA-Ebene) gegeben ist ? Um diese Fragen zu beantworten, werden unterschiedliche Zellsysteme, wie Endothelzellen, Hepatomazellen und Oozyten verwendet. Um den biochemischen Teil des Projektantrages durchzuführen, soll humanes SAA4 in Hefe (pichia pastoris) exprimiert werden. Wir glauben, daß die den vorgeschlagenen Experimenten zugrunde liegenden Resultate neue und nützliche Information über die biologischen Eigenschaften von SAA4, einem Protein mit bisher unbekannter Funktion, liefern.

Die Serum Amyloid A (SAA) Protein-Familie unterteilt sich in zwei unterschiedliche Gruppen, (i) die akute-Phase SAA Proteine und die konstitutiv exprimierten SAA Proteine. Akute-Phase-SAA Proteine sind spezifische Entzündungsmarker, deren Plasmakonzentration während inflammatorischer Ereignisse bis zum 1000-fachen der Ausgangskonzentration ansteigen. Desweiteren gelten Akute-Phase-SAA Proteine als Vorläuferproteine bei der sekundären, reaktiven Amyloidose und stellen auch den Hauptapolipoproteinanteil von "Lipoproteinen mit hoher Dichte" während massiver Entzündungen. Somit sind Akute-Phase SAA Proteine in der Lage, die biologischen Eigenschaften ihres physiologischen "Carriers" zu beeinflussen. Im Gegensatz dazu sind die Plasmakonzentrationen des konstitutiv-exprimierten SAA während der Akute-Phase Reaktion lediglich um den Faktor 5 erhöht. Im Gegensatz zu den Akute-Phase SAA Isoformen, die in allen Säugetieren mit hoher Homologie vorkommen, ist das konstitutiv-exprimierte SAA nur bei Mensch und Maus nachweisbar. Das konstitutive SAA (auch SAA4 genannt) ist hepatischen Ursprungs. Jedoch wurden bisher keine Funktionen für dieses Protein beschrieben. Daher wurden - entsprechend der Projektzielsetzung - vorerst Expressionssysteme etabliert, um das humane SAA4 in ausreichender Menge zur Verfügung zu haben. Im Gegensatz zum Expressionssystem in Pichia pastoris (einem Hefesystem), stellte sich die Etablierung des Expressionssystem in Escherichia coli als geeignete Methode für die Isolierung großer Mengen an SAA4 heraus. In einem Ansatz wurde versucht, eine physikochemische Charakterisierung (CD- Spektren und Kristallisationsversuche) des gereinigten SAA4 Proteins zu erreichen. Ein weiterer, auf die biologische Funktion von SAA4 abzielender Projektansatz galt der durch SAA4-induzierten intrazellulären Signaltransduktions-Kaskade. Preliminäre Untersuchungen mittels Expressionsklonierungsmethoden in Oozyten ergaben keinen direkten Rückschluß auf einen einzelnen, spezifischen SAA4-Rezeptor. Eine durch SAA4 bedingte Erhöhung intrazellulärer Kalziumspiegel in unterschiedlichen zellulären Systemen ist offensichtlich durch unterschiedliche Mechanismen, wie Kalzium-Kanäle, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, und die Bereitstellung von Kalzium aus intrazellulären Depots, bedingt. Die durch SAA4 induzierten Wege der Signaltransduktion beinhalten die Aktivierung von Phospholipase C, die weitere Aktivierung von Proteinkinase C(s) und anschließende Aktivierung von Phospholipase A2, die ihrerseits die Aktivierung der Eikosanoid-Synthese und im speziellen eine erhöhte Biosynthese von Prostaglandinen bedingt. Wir sind der Meinung, daß die vorliegenden Daten einen ersten Ansatz für weitere physiologische Funktion eines bisher nicht untersuchten Proteins darstellen.