MALDI Massenspektrometrie v.nichtkovalenten Biokomplexen

Forschungsprojekt P 14181MALDI Massenspektrometrie vo nichtkovalenten BiokomplexenGünter ALLMAIER 24.01.2000 Die Entwicklung von "sanften" Desorptions/Ionisierungstechniken hat in den letzten zwei Jahrzehnten zu dramatischen Fortschritten in der massenspektrometrischen Charakterisierung von hochmolekularen Biomolekülen, wie Proteinen und Kohlenhydraten, geführt - insbesondere die zerstörungsfreie Generierung von intakten, geladenen Molekülen derartiger Biopolymere in der Gasphase. Während bei anderen Techniken, wie der Desorption/Ionisation mit hochenergetischen Spaltfragmenten des Califomiums-252 (Plasmadesorption, PD) oder mit schnellen, neutralen Atomen (Fast Atom Bombardment, FAB) oder unter Anwendung eines Elektrosprayvorganges (Elektrosprayionisation, ESI), noch Molekulargewichtsbegrenzungen bestehen, gelang mit Hilfe der matrixunterstützten Laserdesorptions/lonisations-Flugzeitmassenspektrometrie (MALDI) - Photonen werden zur Überführung in die Gasphase und Ionisation herangezogen - ein Durchbruch zu Makromolekülen jenseits eines Molekulargewichtes von 1 Million Dalton. Während die MALDI als auch ESI Massenspektrometrie bereits erfolgreich zur exakten Molekulargewichts- und Primärstrukturbestimmung von Biopolymeren eingesetzt wurden, eröffnet die - erst in jüngster Zeit beobachtete - direkte Charakterisierung von hochmolekularen Biokomplexen` basierend auf nichtkovalenten Wechselwirkungen (nichtkovalente Komplexe) durch die MALDI Massenspektrometrie zukunftsweisende Perspektiven für die analytische Biochemie (z.B. Studien von nichtkovalenten Interaktionen von HIV Proteinen mit Inhibitoren oder von Multiproteinkomplexen) und supramolekulare Chemie. Im Gegensatz zu anderen massenspektrometrischen Desorptions/Ionisationstechniken arbeitet man in der UV MALDI Massenspektrometrie meist aus einer homogenen, festen Phase. Die Probenpräparation, d.h. die Einbettung von intakten, meist recht labilen, nichtkovalenten Komplexen in ein festes, meist stark saures Matrixsystem, ist daher eine sehr subtiles Unterfangen. Derzeit stellen diese: denaturierenden (Zerstörung der Komplexe) Probenpräparationsbedingungen das Hauptproblem für einen breiten Einsatz dar. Nichtsdestotrotz kann dieser Vorgang unter gewissen Bedingungen erfolgreich durchgeführt werden. Eine Bestimmung der entscheidenden Parameter bei diesem Präparationsvorgang und nachfolgende Optimierung sowie Standardisierung dieser würde neue Einsatzgebiete und Fragestellungen eröffnen. Eine Schlüsselrolle kommt dabei Faktoren wie pH, Lösungsmittelsystemen und Temperatur zu. Der Einsatz von flüssigen Matrices, die mildere Desorptionsbedingungen erlauben, stellt einen weiteren, neuen Ansatz dar um dieses Problem zu reduzieren oder zu beseitigen. Die Untersuchung des Einflusses von Parametern betreffend der Ionenquellenkonstruktion auf das Desorptions/Ionisationsverhalten von nichtkovalenten Komplexen ist ein weiteres Projektziel. Für die zukünftige Entwicklung der vielversprechenden Ansätze sind die Aufklärung der Matrixchemie und des Desorptionsvorganges von entscheidender Bedeutung und somit zentraler Punkt des Forschungsprojektes. Die besondere Bedeutung der MALDI MS für die direkte Bestimmung von sehr großen, nichtkovalenten Homo- oder Heteroproteinkomplexen liegt darin, daß die MALDI Flugzeitmassenspektrometrie im linearen Modus einen praktisch unbegrenzten Massenbereich aufweist bei gleichzeitig sehr geringem Substanzbedarf (im Pikomolbereich - 10-12 - und darunter) und eine exakte Stöchiometriebestimmung erlaubt. Die systematische Untersuchung, Optimierung und Verbesserung der MALDI MS Bedingungen für die direkte Analyse von, im Allgemeinen sehr labilen, nichtkovalenten Biokomplexe, sollte einen Quantensprung in Bezug auf die massenspektrometrischen Zugänglichkeit von biochemisch und pharmazeutisch wichtigen, hochmolekularen nichtkovalenten Komplexen bringen. Das große, analytisch-chemische Potential der direkte Charakterisierung von supramolekularen Strukturen und molekularen Erkennungsprozessen in Proteinen (z.B. Antigen-Antikörper-Komplexe, Enzym-Substrat- Komplexe, Rezeptor-Ligand-Interaktion) jenseits von 200000 Dalton mittels der MALDI Flugzeitmassenspektrometrie ist erst in Umrissen erkennbar.