Ionentransport und Regulation des pHi in Pseudobranchienzellen

Die Pseudobranchie der Teleostier ist eine Hemibranchie, die im Kiemenraum auf dem Operculum lokalisiert ist. Obwohl sie bereits im 19. Jahrhundert beschrieben wurde und seitdem immer wieder die Aufmerksamkeit der Biologen geweckt hat, ist die Funktion dieses Organs weitgehend unklar. Unter anderem wurde diskutiert, daß die Pseudobranchie als osmoregulatorisches Organ, als respiratorisches Organ, als sensorisches Organ oder auch als Hormondrüse arbeitet, aber keine dieser Vorstellungen konnte bisher nachhaltig bestätigt werden. Messungen an der isoliert perfundierten Pseudobranchie ergaben, daß das Blut bei der Passage des Organs angesäuert wird, aber die Sauerstoffkapazität des Hämoglobins war noch nicht reduziert, d.h. der für Fischhämoglobin charakteristische Root-Effekt hatte noch nicht eingesetzt. Daraus wurde nun die Vorstellung entwickelt, daß die Pseudobranchie das Blut ansäuert bis kurz oberhalb der Schwelle, an der der Root-Effekt ausgelöst wird. Bei der darauffolgenden Passage des Auges könnte dann durch eine weitere minimale Ansäuerung der Root-Effekt ausgelöst werden. Dadurch würden einerseits im Auge hohe Sauerstoffpartialdrücke erzielt, die erforderlich sind um die avaskuläre Retina ausreichend mit Sauerstoff zu versorgen, andererseits würde aber eine übermäßige Ansäuerung des Blutes vermieden, durch die die Retina geschädigt werden würde. In diesem Projekt soll überprüft werden, ob Pseudobranchienzellen tatsächlich in der Lage sind, das extrazelluläre Milieu auf einen bestimmten pH-Wert zu "titrieren", wie es in dem Modell vorausgesagt ist. Hierzu wird zunächst der Ionentransport durch die Zellmembran der Pseudobranchienzellen analysiert, und die Säuresekretion der Zellen wird in Abhängigkeit vom extrazellulären pH-Wert bestimmt. Eine vom extrazellulären pH-Wert abhängige Säuresekretionsrate läßt erwarten, daß auch die Kontrolle des intrazellulären pH-Wertes beeinflußt. ist. Daher werden in ergänzenden Versuchen die Mechanismen der Regulation des intrazellulären pH-Wertes untersucht. Weiterhin sollen die an der Säuresekretion beteiligten Transporter immunhistochemisch lokalisiert werden, um ein Model für den Protonentransfer durch die Zellmembran der Pseudobranchienzellen zu entwickeln. Zudem soll festgestellt werden, durch welche Mechanismen die Säuresekretion der Pseudobranchienzellen reguliert wird. Im Zusammenhang mit unseren bisherigen Ergebnissen zur Säuresekretion von Gasdrüsenzellen der Fisch-Schwimmblase und mit aktuellen Ergebnissen zur Säure-Basenregulation in Nierenepithelzellen oder Belegzellen des Magens werden unsere Ergebnisse allgemeine Prinzipien der Säure-Basenregulation von Zellen aufdecken, die auf Säuretransport spezialisiert sind.

Die Pseudobranchie der Knochenfische ist eine Hemibranchie, die im Kiemenraum auf dem Operculum lokalisiert ist. Obwohl sie bereits im 19. Jahrhundert beschrieben wurde und seitdem immer wieder die Aufmerksamkeit der Biologen geweckt hat, ist die Funktion dieses Organs weitgehend unklar. Derzeit wird die Vorstellung diskutiert, dass die Pseudobranchie das Blut ansäuert bis kurz oberhalb der Schwelle, an der der Root-Effekt ausgelöst wird. Bei der darauf folgenden Passage des Blutes durch das Auge könnte dann durch eine weitere minimale Ansäuerung der Root-Effekt ausgelöst werden, und das Hämoglobin den gebundenen Sauerstoff freisetzen. Dadurch würden einerseits im Auge hohe Sauerstoffpartialdrücke erzielt, die erforderlich sind um die avaskuläre Retina ausreichend mit Sauerstoff zu versorgen, andererseits würde aber eine übermäßige Ansäuerung des Blutes vermieden, durch die die Retina geschädigt werden würde. In diesem Projekt sollte zunächst eine Methode entwickelt werden, um Pseudobranchienzellen zu isolieren und in Primärkultur zu halten. Die größten Erfolge konnten wir durch Inkubation in Ca2+-freiem Medium und anschließende mechanische Zerkleinerung der Pseudobranchie erzielen. Durch dieses Verfahren ließ sich eine Population von Zellen isolieren, die durch eine reiche Ausstattung mit Mitochondrien, durch sehr viele Einfaltungen der Zellmembran (tubuläres System), und durch das Vorhandensein der Na+ /K+ -ATPase charakterisiert war. Diese Eigenschaften sind typisch für Pseudobranchienzellen. Da Epithelzellen gewöhnlich Cytokeratin exprimieren, wurde weiterhin versucht durch kommerziell verfügbare Antikörper Cytokeratin in diesen Zellen nachzuweisen. Eine sehr starke Expression von Cytokeratin wurde bei einer Gruppe von Zellen gefunden, die klein und weitgehend undifferenziert waren. Ebenfalls positiv reagierte eine Gruppe von Zellen, die zwar eine große Zahl von Mitochondrien aufwies, aber noch kein tubuläres System besaß. In völlig ausdifferenzierten Pseudobranchienzellen dagegen ließ sich epitheliales Cytokeratin kaum nachweisen. Diese Beobachtungen könnten andeuten, dass hier eine Entwicklungsreihe vorliegt, und dass Pseudobranchienzellen im Verlauf der Differenzierung die Expression von Cytokeratin aufgeben. Eine Proliferation oder Differenzierung von Zellen konnten wir jedoch in unseren Primärkulturen nicht beobachten. Die Mechanismen der Säuresekretion wurden einerseits immunhistochemisch durch den Einsatz spezifischer Antikörper, andererseits physiologisch durch die Messung der Säuresekretionsrate der kultivierten Zellen untersucht. Diese Untersuchungen belegten, dass Pseudobranchienzellen Säureäquivalente über verschiedene Transportmechanismen sezernieren können. Neben dem Na+ /H+ -Austauscher, einem Anionentauscher und der V- ATPase spielt offensichtlich auch die Diffusion von CO 2 , das im aeroben Stoffwechsel produziert wird, eine große Rolle. Ein Vergleich mit den Mechanismen der Säuresekretion der Plattenepithelzellen der Kiemen zeigte, dass Pseudobranchienzellen deutlich mehr Säure sezernieren, und dass die Säure zum Teil über andere Mechanismen sezerniert wird. In Kiemenzellen spielt die V-ATPase z.B. unter isosmotischen Bedingungen keine Rolle für die Regulation des Säure-Basenhaushaltes. Die Ergebnisse zeigen somit, dass Pseudobranchienzellen kultiviert werden können, und dass kultivierte Zellen ein sehr gutes Model für die Untersuchung der Zellfunktion darstellen. Die Ergebnisse zur Säuresekretion stehen im Einklang mit der Hypothese, dass Pseudobranchienzellen Säure sezernieren und dadurch den pH-Wert des Blutes, das zu den Augen fließt, erniedrigen.