Pharmakologie der Postsqualen-Cholesterin Biosynthese

Im Gegensatz zu den enzymatischen Schritten der Presqualen-Cholesterin Biosynthese, die insbesondere für die Pharmakotherapie in der Humanmedizin von besonderem Interesse sind (z.B. Statine, Squalenepoxidase- Inhibitoren) war und ist der Postsqualen Stoffwechselweg des Cholesterins weitestgehend unerforscht - sowohl pharmakologisch als auch biochemisch. - Wir isolierten, klonierten und charakterisierten als erste die Delta8- Delta7-Sterol Isomerase (Emopamil-Binde- Protein, EBP) als putatives Zielprotein für Pharmaka, die in Tiermodellen anti-ischämische Wirkungen zeigen. Dieses Enzym ist beim Conradi-Hünermann-Happle Syndrom defizient. - Wir isolierten und klonierten den enigmatischen Sigma1-Rezeptor, das Säugerhomolog der Hefe Delta8- Delta7- Sterol Isomerase. Der Sigma1-Rezeptor ist - im Verhältnis zur Delta8- Delta7-Sterol Isomerase (EBP) - relativ stark im zentralen Nervensystem exprimiert. Dies weist auf ZNS-spezifische Funktionen im Sterol-Metabolismus hin. Sigma1-Rezeptoren sind seit ca. 2 Jahrzehnten von erheblichem pharmakologischen Interesse - jedoch ist ihre eigentliche biologische Funktion bis heute unbekannt. - Wir klonierten die cDNAs und die Gene für die humane und murine Delta7-Sterol Reduktase, die nach Expression im heterologen System durch Teratogene (z.B. AY9944) blockiert wird. Dieses Pharmakon/Toxin - Zielprotein reguliert den Spiegel von 7-Dehydrocholesterin in der Haut von Säugern und ist beim Smith-Lemli- Opitz Syndrom (SLOS) defizient. SLOS wird autosomal rezessiv vererbt und gilt als außergewöhnliches Beispiel für einen metabolischen Defekt, der zu Fehlbildungen führt. - Wir konnten Mutationen des Delta7-Sterol Reduktase Gens von Patienten mit Smith-Lemli-Opitz Syndrom identifizieren. - Wir haben das erste Tiermodell (transgene Maus) für SLOS entwickelt. Auf Grundlage der bisherigen Erfolge wird als erstes Ziel im vorliegenden Antrag die Sigma1-Rezeptor knock-out Maus untersucht, um Hinweise auf die biologische Funktion des enigmatischen Proteins zu finden und um dessen Rolle in der Sigma1-Liganden Pharmakologie zu prüfen. Als zweites Ziel soll die Delta7-Sterol Reduktase knock- out Maus detailliert untersucht werden, um Grundlagen für eine künftige Gentherapie des SLOS zu schaffen. Das dritte Ziel ist es, die Delta7-Sterol Reduktase als Zielprotein für Pharmaka mit Hilfe radioaktiv- und fluoreszenzmarkierter Liganden zu charakterisieren, die ein HTPS von Wirkstoffen ermöglichen. Als viertes Ziel soll die Regulation der Delta7-Sterol Reduktase auf genomischer und posttranskriptionaler Ebene untersucht werden. Die zu diesen Zielen führenden Untersuchungen werden in Zusammenarbeit mit nationalen und internationalen Wissenschaftlern (Universitäten, Industrie) durchgeführt. Es wird erwartet, daß wichtige Beiträge zur Pharmakologie der Postsqualen-Cholesterin Biosynthese sowie für die Schnittstellen zwischen Genetik, Biochemie und Klinik aus dem vorgeschlagenen Projekt resultieren.

Unser Projekt betraf Enzyme, die in der Biosynthese des Cholesterins beteiligt sind (3ß-Hydroxysteroid 7- Reduktase, E.C. 1.3.1.21; und 8-7 Sterol Isomerase, EC 5.3.3.5) sowie verwandte Proteine, die strukturelle Homologien zur Sterol Isomerase der Hefe aufweisen (i.e. Sigma 1 Rezeptor). Die Sterol Isomerase der Hefe (ERG2), die Säuger Isomerase und der Sigma 1 Rezeptor besitzen hohe Bindungsaffinität für e.g. Ifenprodil. Alle drei Proteine binden außerdem Steroide bzw. Intermediate der Cholesterinbiosynthese. Die biologische Funktion des Sigma 1 Rezeptors ist nicht bekannt, obwohl eine Wechselwirkung mit den spannungsabhängigen Kaliumkanälen Kv 1.4 und Kv 1.5 gezeigt wurde. Wir erachteten es als möglich, dass aus Enzymen der Cholesterinbiosynthese Proteine mit neuer biologischer Funktion generiert wurden, die Intermediate oder Metabolite von Steroiden/Sterolen binden und als Signalmoleküle bzw. Transporter dienen könnten. Smoothened (im Hedgehog Signal-transferweg) wird durch bislang unbekannte endogene Sterole reguliert wie aufgrund von Bindungsstudien mit dem markierten Steroid Cyclopamin vermutet wird. Wir konnten ein zur 8-7 Sterol Isomerase homologes Protein identifizieren, als EBPL (emopamil-binding-protein-like) bezeichnet. Das Gen ist auf dem humanen Chromosom 13q14.2 lokalisiert und weist 31% Identität bzw. 52% Simalarität zur Isomerase auf. Im Gegensatz zu den strukturell bzw. enzymatischen Verwandten (8-7-Sterol Isomerase der Hefe und des Säugers) bindet EBPL keine tritiierten Sigma Liganden wie z.B. [H3 ]-Ifenprodil. Selbst nach Mutation von Tryptophan 91 in EBPL in das (für die 8-7 Sterolisomerase) katalytisch essentielle Tyrosin fanden wir keine Isomerase Aktivität im Hefestamm WAO (eine erg 2-3 Mutation mit kompletten Fehlen der Hefeisomerase). Nach Blockade der Cholesterinbiosynthese in Hep G2 Zellen mit Mevinolin werden 8- 7-Isomerase und 7-Sterol Reductase mRNA hochreguliert. Die EBPL mRNA blieb unreguliert. Wir schließen daraus, dass EBPLs (wie Sigma 1 Rezeptoren) neue Funktionen nach Verlust enzymatischer Aktivität gewonnen haben. (Signaltransduktion? intrazellulärer Transport von Sterol-modifizierten Proteinen? Regulation der Neuro-Steroid Synthese in Hirn?). Eine k.o Maus ist in Arbeit. Ein Mausmodell für das Smith-Lemli-Opitz-Syndrom wurde generiert, indem das Enzym 7 Reduktase ausgeschaltet wurde. Homozygote (-/-) Mäuse säugen nicht, haben Schwierigkeiten bei der Atmung und sterben 24 Stunden p. partum. Nichtsdestoweniger bietet sich das Tiermodell (mit embryonalen Zellen) als System zum weiteren Studium der molekularen Ereignisse an, die zu Fehlbildungen, Synthese abnormaler Steroide bzw. Neurosteroiden führen.