BidirektionaleKopplung im Skelettmuskel

Forschungsprojekt P 13831Bidirektionale Kopplung im SkelettmuskelManfred GRABNER28.06.1999 Koordinierte Muskelbewegungen erfordern die kontrollierte Freisetzung von Ca2+ Ionen aus intrazellulären Ca2+ Speichern. Im Skelettmuskel wird die intrazelluläre Ca2+ Freisetzung über eine allosterische Interaktion zweier Ca2+ Kanäle geregelt, dem spannungsabhängigen L-Typ Ca2+ Kanal oder Dihydropyridinrezeptor (DHPR) der Plasmamembran und dem Ryanodinrezeptor (RyR) des Sarkoplasmatischen Retikulums (SR). Durch Membrandepolarisation hervorgerufene Konformationsänderungen des DBPR werden an den RyR weitergegeben, wodurch Ca2+ aus SR Speichern freigesetzt wird. Neben dieser orthograden Signalweitergabe (elektromechanische Kopplung) wird vom RyR auch ein retrogrades Signal an den DBPR vermittelt, wodurch dessen Aktivität als Ca2+ Kanal verstärkt wird. Wir konnten kürzlich zeigen, daß ein Sequenzmotiv an der intrazellulären Verbindung der homologen Domänen II und III des Skelettmuskel-DBPR für die Signaltransduktion in beide Richtungen (bidirektionale Kopplung) verantwortlich ist, doch wird es noch etliche Anstrengungen kosten bis das Phänomen der bidirektionalen Kopplung voll verstanden ist. Das erste Teilziel dieses Projektes besteht in einer verfeinerten Analyse dieses Sequenzmotivs bis hin zum Minimalmotiv. DBPR Mutanten sollen in der dysgenen (Fehlen funktioneller DBPRs) Skelettmuskel-Zellinie GLT expremiert werden und mittels elektrophysiologischer Methoden auf erhöhte Stromdichte (durch RyR aktivierte DBPRs) und intrazelluläre Ca2+ Freisetzung (durch DBPR aktivierte RyRs) analysiert werden. Auch andere intrazellulären DBEPR-Sequenzbereiche sollen im selben Modus auf putative, zusätzliche Interaktionsmotive untersucht werden. Durch eine kürzlich an der Verbindungssequenz der DBPR-Domänen III-IV beschriebenen Punktmutation, die zu Maligner Hyperthermie (MH; eine durch Narkosegase hervorgerufene übersteigerte Ca2+ Freisetzung durch RyR) führen kann, kommt diesem Aspekt besondere Bedeutung zu. Zusätzlich soll auch diese MH Mutante R1086H bzgl. ihrer RyR Interaktion sorgfältig elektrophysiologisch charakterisiert werden. Peptide, die dem/den Minimalmotiv(en) entsprechen, sollen als putative Kompetitoren der bidirektionalen Interaktion getestet werden. Eine Blockade der Interaktion würde ein starkes, zusätzliches Argument für eine Protein-Protein Interaktion darstellen. Urn herauszufmden, ob es sich um eine direkte Interaktion handelt oder ob noch zusätzliche molekulare Partner involviert sind, wollen wir die ermittelten Minimalmotiv-Peptide als "Köder" einsetzen um sie gegen eine Phagenbank ("phage display library") aus Zufallspeptiden auf Interaktion zu testen. Ersetzt man die Verbindungssequenz der DBPR-Domänen II-III eines kardialen DHPR durch SkelettmuskelDBPR Sequenz, so wird diese Chimäre zur bidirektionalen Kopplung befähigt. Da dies eine für Herz-DBPRs atypische Nähe zum RyR voraussetzt, muß man einen räumlichen molekularen Steuereffekt dieser Skelettmuskel-DBPR II-III Sequenz annehmen, der damit auch zur Bildung von Tetraden führen müßte. Unter Einsatz der "freeze-fracture" Methode wollen wir dieser Hypothese - einer positiven Korrelation zwischen Tetradenbildung und der Fähigkeit zu bidirektionaler Kopplung - nachgehen.

Das Hauptziel dieses Projektes war die molekulare Analyse der Interaktion zweier Ca2+ Kanäle, die Leitstrukturen bei der Initiation der Muskelkontraktion darstellen. Methoden der Molekularbiologie, der Elektrophysiologie, Immunzytochemie und der "freeze-fracture" Elektronenmikroskopie kamen dabei zur Anwendung. Koordinierte Muskelbewegungen erfordern die kontrollierte Freisetzung von Ca2+ Ionen aus intrazellulären Ca2+ Speichern. Im Skelettmuskel wird die intrazelluläre Ca2+ Freisetzung über eine Protein-Protein Interaktion zweier Ca2+ Kanäle geregelt, dem spannungsabhängigen L-Typ Ca2+ Kanal oder Dihydropyridinrezeptor (DHPR) der Plasmamembran und dem Ryanodinrezeptor (RyR1) des Sarkoplasmatischen Retikulums (SR). Durch Membrandepolarisation hervorgerufene Konformationsänderungen des DHPR werden an den RyR1 weitergegeben, wodurch Ca2+ aus SR Speichern freigesetzt wird, was schließlich durch Aktivierung der Proteine des Sarkomers zur Kontraktion der Muskelfaser führt. Neben dieser orthograden Signalweitergabe (elektromechanische Kopplung, EMK) wird vom RyR auch ein retrogrades Signal an den DHPR geleitet, wodurch dessen Aktivität als Ca2+ Kanal verstärkt wird. Diese Signaltransduktion in beide Richtungen (bidirektionale Kopplung) wird über eine intrazelluläre DHPR-Domäne, den sogenannten "II-III loop" vermittelt. Durch unsere Arbeit gelang es Struktur-Funktionsbeziehungen der zwei essentiellsten Determinanten für diese bidirektionale DHPR<=>RyR Interaktion herzustellen. Diese bestehen in i) einer engen Ko-lokalisation der beiden Kanäle als Grundvoraussetzung für eine physische Interaktion, und ii) einer spezifischen molekularen Domäne im II-III loop, die dem DHPR die allosterische Interaktion mit dem RyR erlaubt. Ad 1) Die Verwendung von DHPR Chimären ermöglichte uns, eine kurze Sequenz von 55 Aminosäuren im C- Terminus des DHPR zu identifizieren, wodurch der DHPR in größte Nähe des RyR, d.h., in die Triaden der Muskelzellen, geleitet wird. Zusätzlich erwies sich durch die "freeze-fracture" Elektronenmikroskopie, daß der II- III loop bei der Feinlokalisation von 4 DHPRs in eine kleeblattförmige Assoziation mit dem homotetrameren RyR1, eine Hauptrolle spielt. Ad ii) Das Studium von DHPR-Feinchimären und Punktmutanten erlaubte es uns, im DHPR II-III loop 4 Aminosäuren zu identifizieren, die für die skelettmuskelartige EMK essentiell sind. Unsere Ergebnisse zeigen eine eindrucksvolle Korrelation zwischen den Eigenschaften der EMK der individuellen Konstrukte und der berechneten Sekundärstruktur (kardial = a-helikal und skelettmuskelartig = random coil) der II-III loop Interaktionsdomäne. Diese Befunde liefern Evidenz dafür, daß die Sekundärstruktur der DHPR-RyR1 Interaktionsdomäne im DHPR II-III loop den gewebsspezifischen Modus der EMK bestimmt. Je mehr wir über die Mechanismen der EMK im Skelettmuskel lernen, um so eher werden wir eines Tages in der Lage sein, die Symptome pathologischer Veränderungen dieser DHPR-RyR Interaktion, wie Maligne Hyperthermie (MH) oder Central Core disease (CCD) zu beherrschen.