Subzelluläre Lokalisierung von Pflanzen-Glykosyltransferasen

Forschungsprojekt P 13828Subzelleläre Lokalisierung von Pflanzen-GlycosyltransferasenHerta STEINKELLNER28.06.1999 Die N-Glykosylierung ist eine der wichtigsten posttransiationalen Protein-Modifikationen in allen eukaryotischen Zellen. Dieser enzymatische Vorgang beginnt im endoplasmatischen Reticulum und wird im Golgi-Apparat zu Ende gebracht. Eine Anzahl von Enzymen arbeitet in einer genau definierten Abfolge und verändert so die durchgeschleusten Proteine. Im Gegensatz zu den Zellproteinen die diese Organellen durchwandern, bleiben Glykosylierungsenzyme im ER oder Golgi stecken. Obwohl die Beteiligung bestimmter Abschnitte eines Enzyms an der Retention nachgewiesen werden konnten, ist bislang nicht genau geklärt welche Signale weiters dazu benötigt werden. Weiters konnte gezeigt werden, dass der Mechanismus der Golgi Retention sich in allen Eukaryonten ähndelt muß, da zumindestens eine Säuger Glykosyltransferase im Pflanzen-Golgi stecken bleibt. Durch die genaue Charakterisierung von mehreren Enzymen, die an der N-Glykosylierung von Säugetierzellen beteiligt sind, konnte eine detaillierte topologische Verteilung im Golgi erzielt werden. Aufgrund schlecht charakterisierter Golgi residenter Proteine gibt es bislang nur eine sehr ungenaue Charakterisierung des pflanzlichen Golgi Apparates. So gut wie keine Studien gibt es über pflanzliche Golgi "targeting" Signale. Ziel dieses Projektes ist es die subzelluläre Lokalisierung der kürzlich klonierten pflanzlichen Glycosyltransferasen beta1-2N-Acetylglucosaminyl-transferase I (GlcNAc-TI) und alphal-3 Fucosyltransferase (FucT), und ihre Golgi "targeting" und Retention-Sequenzen zu eruieren. Um dieses Ziel zu erreichen sollen die beiden Enzyme in der Modelpflanze Nicotiana benthamiana überexprimiert, und mittels elektronenmikroskopischer Studien die subzeliuläre Lokalisierung ermittelt werden. Durch Ko-Lokalisierungsexperimente soll eruiert werden ob der pflanzliche Golgi, wie in Säugerzellen, in Kompartimente unterteilt ist. Weiters soll festgestellt werden, welche Teile der Enzyme für das "targeting" und die Retention verantwortlich sind. Dazu soll die cytoplasmatische-transmembrane-Stamm-(CTS) Region der beiden Enzyme oder Teile davon an ein Reportergen (gfp) fusioniert und rekombinant exprimiert werden. Die Detektion der subzelluldren Lokalisierung erfolgt mittels Konfokal-laserscan Mikroskop wobei eine genaue Ko-lokalisierung der verschiedenen Konstrukte durch das Verwenden von gfp-Molekülen mit unterschiedlichen Emission-Wellenlängen erfolgt. Die Ergebnisse sollen Aukunft über Signale geben die an der GolgiTargeting/Retention beteiligt sind.